[发明专利]一种基于高通量测序技术的肺癌体细胞突变检测分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域,特别涉及一种基于高通量测序技术的肺癌体细胞突变检测分析方法。本发明主要分析具有正常组织和肿瘤组织配对的外显子测序样本数据。

背景技术

我国是一个肺癌的高发国家，目前肺癌特别是非小细胞肺癌已证实与多种基因突变、融合和基因扩增有关,但是目前的主流分析程序中只能针对其中的单核酸突变、基因融合或者扩增中的一种进行分析，且现有的分析方法中仍然存在一定的假阳性和假阴性的问题，这势必为后期临床为肺癌患者的靶向治疗用药造成困扰，影响患者的治疗效果。因此本方法拟通过更加严格、更加全面的分析方法实现对肺癌组织的各种类型的体细胞突变进行检测，以期为肺癌患者的靶向治疗用药提供更加准确的指导。

现有分析方法存在以下几点问题：

(1)检测结果的可靠性：由于不同方法的过滤和统计方法的不同，现有的分析方法仍然存在一定的假阳性和假阴性问题。

(2)检测指标单一：现有的分析方法中大多只能检测单核苷酸突变(SNP),插入缺失(Indel)，还有一些只能检测基因融合(Gene Fusion)或者拷贝数变异(CNV)。

(3)报告结果单一:现有分析方法中，结果中只有一些简单的图表报告，还有很多数据信息没有有效的呈现。且现有的图表在可视化、形象化角度来说还可以进一步提升。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术所存在的不足而提供一种基于高通量测序技术的肺癌体细胞突变检测分析方法。

本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现：

一种基于高通量测序技术的肺癌体细胞突变检测分析方法，包括如下步骤：

(1)质量控制步骤；

(2)序列对比步骤；

(3)变异检测步骤；

(4)变异注释步骤；

(5)结果报告步骤。

在本发明的一个优选实施例中，所述质量控制步骤(1)具体是：

(1.1)利用FastQC查看测序质量结果，查看序列测序得分值分布、GC分布和重复率；统计所有序列的总Total Reads，Total bases、Q20、Q30、GC含量、N字符的数量及相关比例；

(1.2)去除序列中含有的接头序列；

(1.3)对序列首尾的index或者测序质量比较差的reads进行trimming；

(1.4)利用滑动窗口，根据得分值对低质量的Reads进行过滤，如去除N或者低得分值的序列。

在本发明的一个优选实施例中，所述序列对比步骤具体是：

(2.1)通过bwtsw算法对参考基因组构建比对索引；

(2.2)通过BWA-MEM算法将目标序列比对到基因组；

(2.3)利用picard里面的MarkDuplicates去除由于PCR引入的重复序列,并利用samtools提取唯一比对上参考基因组的序列；利用GATK-RealignerTargetCreator来确定在INDEL附近需要进行重比对的区域，利用IndelRealigner在确定的区域内进行重新比对；

(2.4)对(2.3)步骤产生的比对文件的碱基质量进行重新矫正。

在本发明的一个优选实施例中，所述变异检测步骤具体是：

(3.1)本发明步骤通过采用启发式算法的varscan-somatic程序对样本进行单核苷酸突变检测。

(3.2)本发明步骤通过基于de Bruijn graph方法的Scaple程序，对序列区域进行微组装以更加高效的检测目标区域的插入缺失变异。

(3.3)本发明步骤通过Varscan的copynumber、copyCaller程序根据目标区域的测序深度差异，对样本进行拷贝数变异检测；

(3.4)本发明步骤通过factera程序根据不一致的reads clusters对样本进行基因融合检测。

在本发明的一个优选实施例中，所述变异注释步骤具体是：

(4.1)该发明步骤主要进行位置注释，确定变异位点在基因组中的相应位置，并且分析变异位点是否会造成氨基酸改变，编码蛋白的改变。

(4.2)发明步骤主要通过和目前通用的变异数据库进行比较，如和dbSNP、esp6500、exac03等数据库的变异位点进行比较，据此获得相关群体变异频率和变异位点号。

(4.3)该发明步骤主要通过和相关疾病数据库如clinvar，dbnsfp进行比对获得相关变异位点的致病可能性。