[发明专利]一种重组毕赤酵母菌生产肝脏解毒酶的发酵生产工艺

说明书

本发明提供一种重组毕赤酵母菌生产肝脏解毒酶的发酵生产工艺，包括菌种准备、菌株活化、一级种子培养、二级种子培养、发酵培养和诱导表达以及放罐步骤。所述的菌种为含肝脏解毒酶基因的重组毕赤酵母菌。所述的发酵培养和诱导表达包括四个阶段，分别为菌体富集阶段、甘油补料发酵阶段、碳源饥饿阶段和高密度高溶氧诱导补料阶段。本发明通过重组毕赤酵母菌发酵生产的肝脏解毒酶的酶活达到50000‑56000 U/g，发酵时间为132‑144h。

技术领域

本发明涉及一种重组毕赤酵母菌的发酵生产工艺，具体涉及一种重组毕赤酵母菌生产肝脏解毒酶的发酵生产工艺，属于生物工程技术领域。

背景技术

发酵工程，是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。发酵工程的内容包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等方面。

由于生物反应的复杂性，在从实验室到中试，从中试到大规模生产过程中会出现许多问题，这就是发酵工程工艺放大问题。从发酵液中分离和纯化产品的技术：包括固液分离技术（离心分离，过滤分离，沉淀分离等工艺），细胞破壁技术（超声、高压剪切、渗透压、表面活性剂和溶壁酶等），蛋白质纯化技术（沉淀法、色谱分离法和超滤法等），最后还有产品的包装处理技术（真空干燥和冰冻干事燥等）。这些都是发酵工程领域重点研究的方面。

重组基因工程菌的工业发酵生产更是发酵工程中的重点和难点。工程菌种虽然具有转基因的能力，但怎样实现其有效表达和工业生产，仍然是生产过程中的重要技术环节。

采用普通的毕赤酵母发酵工艺进行扩大发酵重组毕赤酵母菌，表达肝脏解毒酶的效率非常低，无法从中提取出有效的肝脏解毒酶，获得的肝脏解毒酶酶活非常低；因此，怎样提高转基因毕赤酵母通过发酵生产得到的肝脏解毒酶的酶活是本领域研究的重要课题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种重组毕赤酵母菌生产肝脏解毒酶的发酵生产工艺，显著提高肝脏解毒酶的酶活。

为解决现有的技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种重组毕赤酵母菌生产肝脏解毒酶的发酵生产工艺，包括菌种准备、菌株活化、一级种子培养、二级种子培养、发酵培养和诱导表达以及放罐步骤。

所述的菌种为含肝脏解毒酶基因的重组毕赤酵母菌。

所述的发酵培养和诱导表达包括四个阶段，分别为菌体富集阶段、甘油补料发酵阶段、碳源饥饿阶段和高密度高溶氧诱导补料阶段。

所述的菌体富集阶段；通过反馈流加氨水的方式控制PH 6.5～7.0，空气通气比为0.6vvm，转速为120～160 r/min；发酵温度为25℃±0.5；罐压是0.05～0.07MPa，DO值为25%～35%，培养12～14 h，本阶段菌体湿重可达250g/L以上。

所述的甘油补料发酵阶段；向发酵罐中流加30%甘油，甘油流加速度为17～20mL·(h·L)^-1，控制空气通气量调为1.4～1.6vvm，控制发酵温度25℃±0.5，罐压0.05～0.07MPa，DO值为25%～35%，甘油补料时间控制22～26 h，菌体OD600达到1.8～2.0。

所述的碳源饥饿阶段；控制发酵罐内温度30℃±0.5，空气通气量为0.8～1.2vvm，罐压为0.05～0.07MPa，进行饥饿培养1～1.5h。

所述的高密度高溶氧诱导补料阶段：流加甲醇和 50%山梨醇溶液1:1混合液；发酵温度控制为24～29℃，控制pH为5.5～7.1，空气通气量为0.8～1.2vvm，罐压为0.05～0.07MPa，DO值为25%～35%。