[发明专利]检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒及制备方法及检测方法

权利要求书

1.一种检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒，其特征在于：包括包被酶标板、酶结合物、校准品、底物、洗液和终止液，包被酶标板为聚苯乙烯包被的CST1抗体，酶结合物为HRP标记的CST1抗体，校准品为CST1抗原，底物为TMB的显色剂，终止液为0.5mol/L的硫酸；洗液为PB的缓冲液，所述洗液如下：1000mL洗液中含有90g的NaCl、29g的Na₂HPO₄·12H₂O、2.97g的NaH₂PO₄·2H₂O、以及10ml的吐温20。

2.一种制备如权利要求1所述的检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒的方法，其特征在于：所述制备方法的步骤如下：

A、板子制作：

1）用碳酸盐包被缓冲液将CST1抗体稀释至工作浓度，包被96孔酶标板，每孔100μl，2～8℃孵育过夜或37℃烘箱2小时；

2）弃去孔中液体，每孔加入300～350μl的洗液，静置3分钟，弃去洗液，甩干，洗涤3遍；

3）加入终止液，每孔200μl，2～8℃孵育过夜或37℃烘箱2小时；

4）弃去孔中液体，甩干，37℃烘箱过夜；密封；2～8℃保存；

B、酶结合物标记：

1）取5mg HRP溶于0.5 ml 浓度为0.2mol/L、pH值为5.6的醋酸盐缓冲液中；加入0.25 ml新鲜配制的浓度为0.1mol/L的NaIO₄；混匀；4℃保温30min；

2）加入0.5ml体积百分浓度为2.5%的已二醇，混匀；室温置30min；

3）加入5～10mg待标记的抗体，用浓度为1.0mol/L、pH值为9.5的CBS调节pH值至9.0，混匀；透析，4℃过夜；

4）加入0.1ml或0.5mg NaHB₄，混匀；4℃放置2小时后，对浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS透析，4℃过夜；加入中性甘油后分装；

C、酶结合物配制：

用酶稀释液把标记好的酶稀释到1ug/ml；

D、校准品配制：

用校准品稀释液把抗原稀释到20ng/ml，10ng/ml，5ng/ml，2.5ng/ml，0ng/ml。

3.根据权利要求2所述的检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征在于：所述板子制作步骤的工序1）中，CST1抗体的工作浓度为1～3μg/ml。

4.根据权利要求3所述的检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征在于：所述板子制作步骤的工序1）中，CST1抗体的工作浓度为2μg/ml。

5.根据权利要求2所述的检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征在于：所述板子制作步骤的工序1）中，2～8℃孵育过夜的时间为16～24小时；所述板子制作步骤的工序3）中，2～8℃孵育过夜的时间为16～24小时；所述板子制作步骤的工序4）中，37℃烘箱过夜的时间为16～24小时。

6.根据权利要求2所述的检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒的制备方法，其特征在于：所述酶结合物标记步骤的工序3）中，过夜的时间为16～24小时；所述酶结合物标记步骤的工序4）中，过夜的时间为16～24小时。

7.一种如权利要求1～6任一权利要求所述的检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒的检测方法，其特征在于：所述检测方法的步骤如下：

1）取出试剂盒和血清样品，室温平衡15～30分钟；浓缩洗涤液用蒸馏水1∶19稀释，待用；

2）取出包被板，每孔加入50μl标准品、质控血清和血清样品；

3）每孔分别加入酶结合物50μl；

4）微量振荡器振荡30秒使其混合均匀，封膜覆盖，置37℃温育0.5小时；

5）甩干孔内混合物，用洗涤液注满各孔，静置18～22秒，甩干孔内液体，重复5次，最后拍干；

6）每孔加入底物2滴或100μl；

7）微量振荡器振荡30秒，37℃避光反应10分钟以内，用酶标仪测定各孔的OD值。

8.根据权利要求7所述的检测人胱抑素SN的酶联免疫试剂盒的检测方法，其特征在于：所述步骤2）中的标准品为S0～S6。