[发明专利]一种基于荧光淬灭的生物标志物多重检测方法

权利要求书

1.一种基于荧光淬灭的生物标志物多重检测方法，其特征在于包括如下步骤：

羧基量子点修饰适配体DNA分子

将三种不同的发射波长间隔大于50nm的羧基量子点用碳二亚胺法分别修饰三种生物标志物的带有氨基的适配体分子，以一种量子点为例，具体步骤为：用pH7.4 0.01M的磷酸盐缓冲液将量子点稀释成10nM的浓度，向200μL50nM的量子点溶液中加入1mg碳二亚胺和2mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，在室温条件下振荡反应1h，然后用截留分子量为1000的超滤管进行超滤，再用pH7.4 0.01M的磷酸盐缓冲液将其重悬，从而得到适配体修饰的量子点；

金纳米粒子修饰适配体分子的互补序列

将新合成的粒径为15-20nm的金纳米粒子在8000r/min的条件下离心浓缩5倍，测得金纳米粒子的浓度为10nM，将与步骤（1）中三种适配体对应的三种互补DNA分子等量混合，将其加入到200μL 10nM的金纳米粒子中，使得每种DNA分子的终浓度为200nM，DNA分子与金纳米粒子以20:1的摩尔比进行修饰反应，在室温条件下孵育6h后，将金纳米粒子在9000r/min的条件下离心以去除多余的DNA分子；

荧光淬灭体系的形成以及荧光信号的测定

将步骤（1）中得到的适配体修饰的三种量子点等体积混合，分装到PCR管中，每管50μL；将三种生物标志物分子等量混合，再将其稀释成10个浓度，具体浓度为：0.01pg/mL、0.05pg/mL、1pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、20pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、500pg/mL，然后向每管量子点溶液中分别加入以上不同浓度的生物标志物分子10uL，在室温条件下振荡反应30-60min；取反应后的溶液20μL分别加入到步骤（2）中制备的100μL金纳米粒子探针溶液中，在室温条件下孵育1h后，测定每管的三种荧光信号强度，并建立生物标志物分子浓度与相应的荧光信号强度之间的对应关系。

2.根据权利要求1所述的一种基于荧光淬灭的生物标志物多重检测方法，其特征在于所述的三种量子点的发射波长分别为505nm、585nm、645nm。

3.根据权利要求1所述的一种基于荧光淬灭的生物标志物多重检测方法，其特征在于所述的三种生物标志物分子为前列腺特异性抗原、黏蛋白1、凝血酶。

4.根据权利要求3所述的一种基于荧光淬灭的生物标志物多重检测方法，其特征在于所述的前列腺特异性抗原、黏蛋白1、凝血酶的适配体序列以及相对应的互补序列为：

前列腺特异性抗原适配体DNA1：5’-NH₂-ATTAAAGCTCGCCATCAAATAGC-3’；

DNA1的互补序列：5’-SH-ATGGCGAGCTTTAAT-3’；

黏蛋白适配体DNA2：5’-NH₂-GCAGTTGATCCTTTG GATACCCTGG-3’；

DNA2的互补序列：5’- SH-CAAAGGATCAACTGC-3’；

凝血酶适配体DNA3：5’-NH₂-GGTTGGTGTGGTTGG-3’；

DNA3的互补序列：5’-SH-CCAACCACACCAACC-3’。

5.根据权利要求1所述的一种基于荧光淬灭的生物标志物多重检测方法，其特征在于所述的金纳米粒子的粒径为20nm。

6.根据权利要求1所述的一种基于荧光淬灭的生物标志物多重检测方法，其特征在于所述的步骤（3）中适配体修饰的量子点和生物标志物的反应时间为45min。