[发明专利]区别4种短体线虫的PCR‑RFLP方法

说明书

技术领域

本发明涉及短体属线虫的检测技术，具体涉及区别4种短体线虫的PCR-RFLP方法。

背景技术

短体属线虫(Pratylenchus Filipjev, 1936)是一类重要的迁移性植物内寄生线虫，能够严重破坏植物根部组织，导致根系腐烂。目前全球已经发现的短体属线虫有近80种，我国于2007年将短体属线虫（非中国种）列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。其中咖啡短体线虫P. coffeae、卢斯短体线虫P. loosi、穿刺短体线虫P. penetrans、伤残短体线虫P. vulnus在全球普遍发生，在我国口岸的截获频次很高。尽管这4种线虫不是检疫对象，但是对其进行准确鉴定，有助于我国口岸检疫过程中做出快速筛选，排除非重点关注的种类，从而能准确截获其他检疫性有害生物。目前检测短体线虫的方法主要是特异性PCR方法，虽比较便捷，但每对引物都分别针对一种线虫，如公开号为CN 103397085 的发明专利申请，就公开了利用穿刺短体线虫18S区设计了特异性检测引物。鉴定4种线虫则需要用4对引物分别反应，操作相对复杂，且由于不同来源短体属线虫的种内DNA序列存在差异，可能导致特异引物失去特异性。PCR-RFLP方法也是一种线虫鉴定的传统方法，但之前人们所用的目标PCR片段都是核糖体ITS区，其不足之处是不同研究人员所用ITS引物种类不一，导致PCR产物片段大小有差异，且目前已用的方法所需限制性内切酶至少需5种以上。此外，由于ITS区进化速率较快，同种线虫的ITS区重复片段存在序列多态性，从而导致同种线虫的RFLP结果不一致，影响线虫种类鉴定。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种区别4种短体线虫的PCR-RFLP方法，该方法能一次性区别咖啡短体线虫、卢斯短体线虫、穿刺短体线虫和伤残短体线虫，操作简单，种间差异显著。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：参考GenBank中短体属线虫和其他不同来源的短体属线虫核糖体28S基因DNA序列，通过DNAstar中的MapDraw软件和MEGA软件分析其酶切位点，选取合适的限制性内切酶组合，并经过大量实际样品的检测应用评估，发明了一种以线虫核糖体28S基因D2-D3区DNA序列为基础的PCR-RFLP方法。而28S基因十分保守，同种短体属线虫的序列高度一致，使得同种短体属线虫的RFLP结果非常稳定，而不同种的短体属线虫又有显著差异，因而很容易用基于核糖体28S基因D2-D3区的PCR-RFLP方法区分4种常见短体属线虫（咖啡短体线虫、卢斯短体线虫、穿刺短体线虫和伤残短体线虫）。

区别4种短体线虫的PCR-RFLP方法，具体步骤如下：

a、DNA提取：将目标短体属线虫挑入内有双蒸水10μl的PCR管中，放入超低温冰箱-80℃下保存29～31min，取出后立即在85℃条件下恒温5 min，再立即将PCR管的温度速降至56℃，恒温30S，在PCR管中加入浓度为1mg/mL的蛋白酶K溶液2μl和10×EasyTaq缓冲液5μl，PCR管先在56℃下恒温1 h，再在95℃条件下恒温15min，得到DNA提取液，-20℃保存备用；

b、PCR扩增： 50μl反应体系为2×Taq Master Mix(Dye) 25μl, 双蒸水19μl、浓度为40μmol/L的上游引物2μl、浓度为40μmol/L的下游引物2μl，DNA提取液2μl；扩增反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸1min，共35个循环；最后一个循环结束后，72℃延伸10min，得到PCR产物；所述上游引物的核苷酸序列为：5'- ACA AGT ACC GTG AGG GAA AGT TG -3'，下游引物的核苷酸序列为：5'- TCG GAA GGA ACC AGC TACT A -3'；