[发明专利]一种真菌表达载体及其构建方法

说明书

本发明涉及一种含有超表达真菌转录调控因子Som1的真菌表达载体。所述表达载体为由绿色荧光蛋白基因gfp、超表达真菌转录调控因子Som1基因和pBarEx质粒表达载体构成的组成性表达载体。本发明真菌表达载体的构建方法巧妙、选择剂价格低廉、程序简单，同时对利用本发明真菌表达载体的昆虫病原真菌转基因菌株的筛选程序简单、筛选效率高，而且不影响真菌的代谢平衡，通过提高单个基因的表达量就可以提高真菌的抗逆能力和毒力，在转基因真菌研究及市场化过程中具有潜在的、广泛的应用前景。此外，本发明将为安全、高效的基因工程真菌农药等提供良好的技术平台。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种真菌表达载体及其构建方法。

背景技术

据联合国粮农组织(FAO)统计，世界粮食产量因病虫草鼠害造成的损失每年大约占总产的20-35％，其中虫害14％。化学防治目前仍是害虫防治中的一种重要措施，在保障农业增产方面起着积极作用。然而，化学农药的广谱、高毒和难降解等特性引起了一系列的环境和社会问题。随着人类对生存环境的日益重视，要求减少化学农药使用量的呼声越来越高涨，在这种情况下，以生物防治为主的害虫防治策略正受到广泛重视。由于微生物生物防治具有安全和可持续控制的优点，一直受到人们的广泛关注。杀虫微生物农药是利用昆虫病原微生物研制的一大类生物农药，真菌是昆虫病原微生物中最大的一个类群，在自然条件下由真菌致病死亡的昆虫约占全部病原微生物致病死亡的60％，是自然界控制昆虫种群数量的重要因素之一。与细菌、病毒杀虫途径不同，真菌能够直接从昆虫体壁侵染昆虫，真菌可侵染刺吸式口器害虫、鞘翅目害虫以及昆虫的卵和蛹等。同时，真菌杀虫剂对人和其它脊椎动物没有危险，也不伤害昆虫的天敌，对环境的影响很小。目前，已发现杀虫真菌约有100多属、800多种，除担子菌亚门之外，昆虫病原真菌存在于其它所有真菌亚门中。研究应用的主要种类有白僵菌、绿僵菌、玫烟色拟青霉和蜡蚧轮枝菌在内的十多种真菌。真菌是最先被研制成杀虫剂的微生物，绿僵菌和白僵菌等杀虫真菌农药已用于松毛虫、玉米螟和蝗虫等害虫的防治，其中杀蝗绿僵菌制剂被联合国粮农组织推荐为环保型产品，国内外已登记60多种杀虫真菌农药，目前真菌杀虫剂已作为化学农药的替代产品或补充制剂防治多种有害昆虫。虽然昆虫病原真菌在防治害虫方面具有独特的优势，但目前真菌杀虫剂的市场占有率非常低。造成这种情况的主要原因是由于真菌杀虫剂致病过程较长、杀虫较慢，受环境因素(温度、湿度、光照和风雨等)影响大、防效难以稳定。因此，急需提高菌株的综合性状，如产孢能力、抗逆能力和毒力等。

目前，利用基因工程手段改良菌株主要集中在提高真菌毒力方面，并已取得有良好进展。组成性表达绿僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因(Pr1)的工程菌株毒力明显提高，致死时间缩短25％，取食量下降40％；组成性表达白僵菌几丁质酶基因的工程菌株对蚜虫的毒力明显增强，对蚜虫的致死剂量比野生菌株降低50％；由于该基因没有几丁质连接域，将家蚕的几丁质连接域与其融合后，组成性表达的工程菌株杀虫活性进一步提高。将昆虫特异性神经毒素AaIT基因置于昆虫血腔特异启动子的控制下转入绿僵菌，工程菌株对烟草天蛾和埃及伊蚊的杀虫速度分别提高28％和38％，致死中浓度(LC50)分别下降约22倍和9倍，感染昆虫取食量下降50％；神经毒素只有在真菌穿透昆虫表皮后才能表达，进一步提高了工程菌株的安全性。

然而，作为生物农药进入自然环境中，除了杀虫速度以外，对逆境的耐受能力也直接影响真菌杀虫剂在田间的防效稳定性。目前，国内外还缺乏利用基因工程手段对杀虫真菌工程菌株的综合性状进行改良的报道。因此，迫切需要开展以基因工程手段进行杀虫真菌综合性状改良的研究，为选育具有实用价值的安全、高毒力的杀虫真菌工程菌株奠定基础。

发明内容