[发明专利]一株转入红色荧光蛋白的恶臭假单胞菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是一种转入红色荧光蛋白的恶臭假单胞菌及其在促进双孢蘑菇菌丝生长、提高蘑菇产量中的应用。

背景技术

双孢蘑菇(Agaricus bisporus)是世界上栽培最广泛、生产量和消费量最大的一种食用菌，其肉质肥厚、口感鲜美、富含蛋白质、多糖、维生素和不饱和脂肪酸，被誉为“植物肉”，深受国内外消费者喜爱，同时也是我国出口创汇的主要食用菌之一。

双孢蘑菇的正常生长和发育不仅受到各种理化因素诸如温度、湿度、水分, 酸碱度、氧气、二氧化碳和光照等的影响,而且也受到生物因子微生物的显著影响。这些微生物存在于培养料和覆土层中。能为蘑菇生长发育提供必要营养,促进其生长发育的微生物称为有益微生物。覆土是双孢蘑菇栽培过程中的一个重要环节，覆土是指在双孢蘑菇培养料表面覆盖一层3-4cm的泥炭或土粒等材料，防止培养料的水分蒸发，稳定培养料的湿度，改善培养料的通气状况，使菌丝由营养生长转入生殖生长，是蘑菇形成子实体的必要条件。研究表明覆土层中的微生物对双孢蘑菇原基的形成起着非常重要的作用，覆土层中的微生物能够去除双孢蘑菇营养生长阶段产生的自我抑制的挥发性物质，从而解除抑制，促进原基形成。因此利用食用菌与有益微生物的互作关系可广开栽培原料,减少辅料用量,提高食用菌生产经济和社会效益。

生防微生物在土壤或宿主中定殖、扩散和生存竞争能力是显示生防作用的重要指标，对提高和稳定菌剂的生防效果、制定科学的施用技术具有重要意义。但是长期以来一直缺乏直观有效的技术手段对其定殖规律及作用机制进行深入的研究，传统的抗生素标记及放射性同位素标记等技术手段难以直观、准确地区分土著微生物和人工接种微生物从而制约了对生防菌作用机制的研究。发光标记系统等现代基因标记技术的兴起为探明拮抗细菌的定殖动态提供了有效的研究手段。目前，未见蘑菇促生菌剂产品相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种转化有红色荧光蛋白的恶臭假单胞菌及其应用，该分离筛选的菌株能够促进双孢蘑菇生长，提高双孢蘑菇产量的细菌菌株，同时通过基因工程手段在菌株中转入红色荧光蛋白，使其便于检测菌株在双孢蘑菇栽培中定殖情况，本发明是这样实现的：

一株恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，申请人分离筛选了一株能促进双孢蘑菇菌丝生长，提高蘑菇产量的菌株；该菌菌落大小中等，表面湿润，边缘整齐；呈暗红色，革兰氏染色成阳性，形态观察菌体成短杆状，菌体长度 1-2μm。测定菌株16S rDNA部分序列，行进系统发育学分析(菌株的16S rDNA 序列如SEQ ID NO.1所示)，因此确定该菌株属于恶臭假单胞菌属(Pseudomonas putida)；在此基础上，申请人利用基因工程手段向该菌株中转入红色荧光蛋白，并将获得菌株自命名为TK3rfp。

菌株TK3rfp在LB培养基上肉眼观察到暗红色，LB培养液中30℃摇床过夜培养，取出试管放在260nm紫外灯下观察，菌株有明显的红色荧光出现，对菌体进行革兰染色，放至荧光显微镜下观察，经激发光激发呈现出红色荧光。

申请人于2017年6月29日将菌株TK3rfp保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为：CGMCC NO.14367。

本发明分离筛选了一株能促进双孢蘑菇菌丝生长，提高蘑菇产量的恶臭假单胞菌，同时为了便于研究该菌株在覆土层中的定殖，利用基因工程手段在该菌株中转入了红色荧光蛋白，便于对该菌在覆土层中的定殖情况检测及对促进双孢蘑菇生长过程的观察；试验证明，菌株TK3rfp能够促进双孢蘑菇菌丝生长，促进原基形成，对于开发蘑菇生长调节剂或生物肥料开发具有开发前景。

附图说明

图1为菌株TK3革兰氏染色显微照片；

图2为菌株TK3电镜照片；

图3为菌株TK3和TK3rfp在LB平板上菌落形态照片；

图4为紫外光激发状态下的TK3和TK3rfp照片；

图5荧光显微镜下TK3rfp成像照片；

图6为菌株TK3rfp与双孢蘑菇在平板共培养条件下菌丝直径的变化照片；

图7为菌株TK3rfp与双孢蘑菇在试管共培养条件下菌丝长度的变化图片。

具体实施方式

实施案例中涉及到的培养基：

LB培养基：酵母粉5g，NaCl 10g，胰蛋白胨10g，琼脂粉15g，加水定容至1L，调节pH至7.0。