[发明专利]用于评价乙肝肝病NK细胞功能的实用性模型的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种用于评价乙肝肝病NK细胞功能的实用性模型及其构建方法。

技术背景

自然杀伤(natural killer，NK)细胞是机体重要的免疫细胞，与T细胞不同的是其杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，因此称为自然杀伤活性细胞；NK细胞在抗击肿瘤、抗病毒感染和免疫调节发挥重要作用，是人体防御病原体入侵和体内细胞变异发生的第一道防线。根据NK细胞表面CD56密度的不同，可将其分为CD56^bright和CD56^dim两种亚型。NK细胞的功能包括：(a)自然杀伤活性：通过非特异性识别靶细胞并释放杀伤介质，如穿孔素(Perforin)、NK细胞毒因子、肿瘤坏死因子(TNF-α)等。NK细胞活化由抑制性和活化性受体间的平衡所控制。(b)分泌细胞因子，活化的NK细胞可以合成和分泌多种细胞因子，发挥免疫调节作用。

NK细胞在正常肝脏中很丰富，约占肝内淋巴细胞的31％。NK细胞在肝内微环境中的细胞因子介导，包括IL-2、IL-12、IFN-γ；NK细胞作为效应细胞经FasL-Fas系统引起肝细胞凋亡，胞浆颗粒中含有穿孔素和颗粒酶，并分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α抑制病原体感染或肿瘤。因此，NK细胞在清除肿瘤细胞、病毒感染细胞、某些自身组织细胞(如血细胞)、寄生虫等扮演着重要角色，是机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素的主要防线之一，尤其在慢性炎症、肿瘤等严重疾病进展期，体内的T细胞功能塌陷，NK细胞的作用更为重要。因此，客观评价NK细胞功能对疾病状态评估、治疗用药指导、预后判断至关重要。

然而，目前缺乏用于评价肝病NK细胞总体功能的临床检测模型。

肝脏是人体最大的免疫器官，病变肝脏充满和浸润着大量免疫细胞，肝病临床结局与体内免疫功能的修复和改善息息相关。然而，在许多慢性肝病和肝癌患者体内，随着生命组学的发展，免疫系统的相关技术不断进步，从70年代开始的免疫球蛋白、补体等测定，能粗略和间接地估计机体的免疫状态，已经逐步被淋巴细胞亚群、细胞因子的检测替代，代表性的检测手段包括：(1)基于DNA检测的生物学方法，如PCR、RNA印迹、原位杂交等技术，这类方法能够对单一免疫细胞因子进行检测，并研究其调控通路，但不宜作为临床复杂病例的判别；(2)生物活性检测方法，如ELISA、ELISPOT等，这类方法只对单一细胞或者单一免疫细胞分泌因子进行检测，而非对某一群免疫细胞的平均细胞因子水平进行检测，同样，也不利于作为临床复杂病例的判别；(3)流式细胞技术和液态芯片检测：这是目前较为精准的检测技术，可对多个细胞因子进行检测，临床医生根据不同细胞因子水平对患者的免疫状态进行预估，但并未涉及免疫细胞总体功能评价。

可见，以上的所有检测技术都没有涉及免疫细胞总体功能评价的方法，同时无法对多个细胞因子进行检测，以便临床医生根据不同细胞因子水平对患者的免疫状态进行预估，且带有较强的主观性、相当昂贵、操作繁琐，无法广泛应用。

发明内容

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种简单、方便的用于评价乙肝肝病NK细胞功能的实用性模型的构建方法，通过该方法构建的评估模型能够准确评价乙肝肝病NK细胞的总体功能。

为了实现以上发明目的，本发明提供了一种用于评价乙肝肝病NK细胞功能的实用性模型的构建方法，其包括：

(1)将乙肝肝病患者分为慢性肝炎活动期患者(CA)和慢性肝炎非活动期患者(CAN)，利用流式细胞技术检测外周血NK细胞及其亚群的频数分布，并进行两组间的比较；

(2)利用流式细胞技术检测外周血NK细胞及其亚群分泌的细胞因子水平，并进行两组间的比较；

(3)收集患者的临床指标人口统计学、病毒学、肝功能、肝硬度数值，将临床指标与NK细胞免疫评价指标进行相关性分析，找出有密切相关性的临床指标；

(4)以NK细胞功能活跃及NK细胞功能低下为反馈变量，利用多变量logistic回归模型从14个易获得的临床-病毒学指标中筛选出与患者NK细胞功能状态有关的指标。优选地，筛选的方法是逐步变量筛选法，筛选的标准是AIC。在另一个优选的实施例中，利用约登指数(Youden Index)，确定患者免疫功能为活跃组的概率的最佳cutoff值，把患者划分为NK细胞功能活跃组与NK细胞功能低下组；

(5)以Age、Fibriscan、HBeAg、HBcAb、ALB临床-病毒学指标建立评估模型：