[发明专利]一种多环芳烃污染土壤中外源降解菌的施加方法

权利要求书

1.一种多环芳烃污染土壤中外源降解菌的施加方法，其特征在于，步骤如下：

(1)采集土壤样品，测定含水率，-20℃以下保存；

(2)提取样品中的基因组DNA，制得DNA模板；

(3)对步骤(2)制得的DNA模板进行实时荧光定量PCR扩增，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，然后根据标准曲线，计算目标菌数量；所述标准曲线如下：

Y＝-3.365X+37.624；

其中：R²＝0.9999，Y为实时荧光定量PCR反应的Ct值，X为菌的标准质粒拷贝数对数值；

(4)调整土壤含水率至20-50％，疏松土壤，根据土壤多环芳烃污染物含量及土壤营养元素含量，添加氮磷肥料，调节污染土壤的碳、氮、磷的摩尔比为(100～120)：(5～10)：1，投加外源假单胞菌(Psedomonassp.)PPZ-1的数量至10⁹CFU/g土，隔周翻搅一次，维持土壤含水率20～50％，每周检测外源降解菌的数量及多环芳烃残留量，当外源降解菌数量低于10⁷CFU/g土时，补加外源假单胞菌(Psedomonassp.)PPZ-1的数量至10⁹CFU/g土，直至多环芳烃残留量达到处理要求。

2.如权利要求1所述的施加方法，其特征在于，所述外源假单胞菌(Psedomonassp.)PPZ-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCC No.12596。

3.如权利要求1所述的施加方法，其特征在于，所述步骤(3)中，荧光定量PCR扩增的反应体系如下，总体系20μl：

2×SybrGreenqPCR Master Mix10μl；浓度10μM的上游引物0.4μl；浓度10μM的下游引物0.4μl；ddH₂0 7.2μl；DNA模板2μl。

4.如权利要求1所述的施加方法，其特征在于，所述步骤(3)中，荧光定量PCR扩增的反应条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，57℃退火20s，72℃延伸30s，45个循环。

5.如权利要求1所述的施加方法，其特征在于，所述步骤(4)中，多环芳烃为菲。