[发明专利]提高植物营养组织油含量的转基因方法及表达载体和应用

说明书

本发明涉及提高植物营养组织油含量的转基因方法及表达载体和应用，属于基因工程领域。选择LEC2、DGAT1、OLEO2和GAT2四种分别参与不同油脂合成和积累过程的基因，通过与合适的启动子连接，构建多个单/多基因表达载体，通过农杆菌转染将构建的单/多基因表达载体导入到植物营养组织中使其异位或异源表达，从而提高植物营养组织中的油脂含量。此外，该技术还可用于提高植物营养组织中与油脂合成与积累相关的脂溶性物质的生产。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及提高植物营养组织油含量的转基因方法及 表达载体和应用。

背景技术

植物油用途广泛，不仅是食用油的主要来源，而且可用于动物饲料、肥皂、表面活性剂、化妆品、涂料、润滑油，以及生物柴油的生产。然而，由于人口的增长和可耕地面积 的减少，在当前和今后很长的一段时间内，中国都将面临食用油和化工原油短缺的严峻局面。人们寄希望通过提高和改变油料植物的农艺和品质性状(其中包括种子产量、油脂的含量及其脂肪酸组分)，使植物不仅是食用油的主要来源，而且还成为可持续地生产生物能源和化工原料的潜在工厂。

普遍认为，种子中油的生产涉及三个关键要素：(1)将光合产物有效地转化为脂肪酸；(2)将脂肪酸有效地掺入到甘油骨架上；(3)降低脂肪酸的降解。就此而言，油合成机 器的主要元件也存在于营养器官中，这是因为：(1)作为油的主要组成成分，脂肪酸的主要 合成部位是叶绿体或质体，而植物叶片富含叶绿体并提供脂肪酸合成所需的碳水化合物；(2)将脂肪酸组装到甘油骨架上形成油的酰基转移酶基因在营养器官中也有表达，这包括催化中 性油脂三酰甘油合成的最后一步反应的二酰甘油酰基转移酶(DGAT1)基因；(3)在某些逆境 条件下或植物衰老过程中，叶片或茎杆中油的含量呈显著增加的趋势。事实上，叶等营养器 官是可收获的生物质的主要组成部分，叶片尤其为脂肪酸的合成提供最主要的碳源，因而， 如果油合成机器的元件运作正常，叶等营养器官或许是理想的油脂积累的场所。不过，叶在 进化过程中演变为“源”组织，成为高度专化的碳水化合物合成和输出的器官，缺乏脂质积 累的倾向。我们假定营养器官中油合成机器的元件组合搭配不当或运转效率低下是造成低含 油量性状的一个主要原因之一，若能将控制种子油合成的上述三个关键遗传要素有机地整合 到植物营养器官中，油合成与积累能力将会得到增强。

在经典的Kennedy途径中，3-磷酸甘油酰基转移酶(GPAT)、溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)和Acyl-CoA：二酰甘油酰基转移酶(DGAT)分别将脂肪酸组装到甘油的sn-1、 sn-2和sn-3位置上，DGAT被认为是参与种子油脂合成的关键限速酶，且发现衰老叶片中， 此酶参与了TAG的合成。一些研究致力于调查DGAT基因在组成型表达的启动子(如 35S)调控下对植物营养器官中油合成的影响，结果显示，AtDGAT1基因在烟草幼苗中的过 表达可使其TAG含量增至野生型的5.9倍，而叶片中，可高达野生型的7倍。

已有研究表明，在营养组织中过表达脂肪酸合成途径中的关键酶基因或转录因子， 能加速光合产物相脂肪酸的转化以及油脂的合成。Mendoza等在拟南芥中过表达参与种子成 熟和油脂积累调控过程的转录因子LEAFY COTYLEDON2(LEC2)，发现在营养组织中积累了 种子特异的mRNA，并且储存性TAG含量明显增加。与此一致的是，以为表达35S强启动 子驱动的LEC2基因，可以有效提升拟南芥和烟草营养器官中的含油量。但与此同时，幼苗 出现体细胞胚胎发生现象，且组织扭曲变形，影响转基因植株的正常生长。为解决这个问 题，Kim等尝试通过衰老诱导表达的方式，在拟南芥叶片中过表达LEC2基因，其结果与野生型相比，转基因植株的TAG含量增加了3倍，且未出现明显的生长异常。这说明，关键 基因与合适启动子的有机结合对操控植物营养组织中油脂的合成和积累至关重要。但是，基 于载体承受性和表达量的限制，选择何种基因组合并怎样合理地构建转录单元从而实现基因表达仍然是需要首先考虑和解决的技术问题。