[发明专利]一种甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系的选育方法及在甘蓝型油菜育种上的应用

权利要求书

1.一种甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系的选育方法，包括以下步骤：

1）利用甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复材料CLR650为母本与甘蓝型油菜常规品系20B进行杂交，获得F₁群体；选择多株F₁代植株与甘蓝型油菜常规品系20B作为轮回亲本进行回交，构建BC₁分离群体；

2）在幼苗期，利用至少1个外源萝卜片段特异标记对BC₁分离群体进行分子标记辅助选择，拔除标记分析结果呈阴性的单株；在花期选择多株BC₁分离群体中表型接近甘蓝型油菜常规品系20B的单株作为母本，继续用甘蓝型油菜常规品系20B进行回交；重复上述步骤直至获得甘蓝型油菜CLR650的BC₄育性分离群体；

3）拔除BC₄育性分离群体中的不育单株，将保留的可育单株全部在隔离区进行混合授粉和收获，并在盛花期调查后代群体的育性表现，直至获得可育株所占比例超过75%的群体；

4）将可育株比例超过75%的分离群体中可育株全部隔离自交，自交后代中继续选择可育株全部隔离自交，直至获得育性不分离、表型一致的甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系CLR095；

所述外源萝卜片段特异标记的制备方法包括：

a）利用甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复材料CLR650为母本与甘蓝型油菜常规品系20B进行杂交，获得F₁群体，选择多株F₁群体植株进行套袋隔离自交，获得F₂育性分离群体单株，并提取各单株的基因组总DNA；在盛花期调查F₂群体单株育性，分别建立可育株和不育株基因混合池；对甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复材料CLR650进行全基因组重测序，将测序结果与萝卜基因组草图和萝卜细胞质不育恢复基因序列进行比对，获得CLR650的恢复基因及其旁侧外源萝卜序列信息，根据目标区域设计特异引物；

b）将所获得的特异引物利用所述基因混合池筛选，保留可育株基因混合池PCR扩增呈阳性、不育株基因混合池扩增呈阴性的引物，并将筛选到的引物在F₂育性分离群体单株上进行共分离验证，PCR扩增阳性表现与育性表现共分离的引物作为外源萝卜片段特异标记引物；

所述外源萝卜片段特异标记包括CLR9-1~CLR9-20中的一种或多种，所述CLR9-1-CLR9-20的核酸序列分别见SEQ ID No：1~SEQ ID No：20。

2.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系的选育方法，其特征在于，所述步骤1）中选择多株F₁代植株与甘蓝型油菜常规品系20B作为轮回亲本进行回交是指选择2-4株F₁代植株与甘蓝型油菜常规品系20B作为轮回亲本进行回交。

3.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系的选育方法，其特征在于，所述步骤1）中构建BC₁分离群体是指构建群体大小为200-250个单株的BC₁分离群体。

4.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系的选育方法，其特征在于，所述步骤2）中选择多株BC₁分离群体中表型接近甘蓝型油菜常规品系20B的单株作为母本是指选择BC₁分离群体中8-10株表型接近20B的单株作为母本。

5.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系的选育方法，其特征在于，所述步骤4）中，隔离自交的代数为2-3代。

6.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系的选育方法，其特征在于，所述步骤a）中选择多株F₁群体植株进行套袋隔离自交是指选择6-8株F₁群体植株进行套袋隔离自交。

7.一种如权利要求1-6中任一项所述选育方法获得的甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系CLR095在甘蓝型油菜育种上的应用，其特征在于，采用甘蓝型油菜不育系及其保持系和恢复系CLR095，通过三系配套方法进行杂交种生产。