[发明专利]一种基于LC-MS-MS技术的体内蛋白质营养的评价方法

说明书

本发明公开了一种基于LC‑MS‑MS技术的体内蛋白质营养的评价方法。本发明评价方法，包含以下步骤：(1)采集不同肠段内容物，提取分离蛋白成分；(2)测定蛋白浓度；(3)质谱前处理：包括进行全蛋白溶液的消化和脱盐；(4)LC‑MS‑MS分析；(5)数据库搜索；(6)数据处理。本发明将蛋白质组学技术用来鉴定不同肠段内容中蛋白质及其消化产物，在此基础上，可以判断出不同肠段内容物蛋白质及其内容物的来源，通过生物信息学分析，可以更深入了解差异蛋白在机体内部的功能，其中与蛋白质消化代谢有关的酶的基因表达可能存在不同，为进一步科学评价蛋白质的消化利用提供科学依据。

技术领域

本发明属于蛋白质组学技术领域，涉及一种基于LC-MS-MS技术的体内蛋白质营养的评价方法。

背景技术

目前较为权威的体内蛋白质消化率测定的方法是粪氮平衡实验。其原理是膳食蛋白通过食道进入胃肠道，胃中胃蛋白酶将膳食蛋白进行消化，多肽类进入小肠段(十二指肠、空肠和回肠)由胰蛋白酶和糜蛋白酶作用，最后，少量的微生物细胞、肠内粘膜脱落的粪代谢氮和未被完全消化吸收的蛋白质经过结肠时，以粪便的形式排出体外。摄入氮和粪氮的差值占摄入氮的比例即为表观消化率。尽管会添加5％高消化性酪蛋白后再测定粪代谢氮来校正表观消化率从而得到真消化率，但是这种方法并不能如实的反映体内的蛋白质消化吸收情况。这种体内消化率测定方法操作复杂、时间长，且实验动物对外界环境的要求较高。传统方法只知道摄入氮和排出氮，缺乏对机体内部的消化吸收代谢情况的深入了解，并不能如实的反映机体内的蛋白消化。因此，有必要建立一套能够如实评价膳食蛋白体内消化的新方法。

蛋白质组学是应用蛋白质分离、鉴定和定量的技术研究蛋白质组的一门学科，基于质谱的蛋白质组学技术更是广泛应用于生命科学领域。生物质谱技术(MassSpectrometry)是蛋白组学研究中的核心技术，是进行蛋白质鉴定的基本手段，能准确的测量肽和蛋白质的相对分子质量、氨基酸序列及翻译后的修饰。目前来讲，液相色谱-质谱联用(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry)技术，已经成为蛋白质高通量分析的主流方法。通常LC与MS是串联的，通过LC分离的肽段在进入MS之前，先经过外加电场使肽段离子化带上电荷。离子化的肽段进入一级MS，确定肽段的精确分子质量、所带电荷数、肽段丰度(即在质谱上的信号强度)等信息后进入二级质谱，通过Mascot数据库搜索、序列比对推断出肽段的氨基酸组成和排列顺序。通过Maxquant软件进行比对数据库，可比对三种来源(宿主、膳食和微生物)的蛋白库，收集对蛋白质在体内消化吸收转化的全部信息。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种基于LC-MS-MS技术的体内蛋白质营养的评价方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种基于LC-MS-MS技术的体内蛋白质营养的评价方法，包含以下步骤：

(1)采集不同肠段内容物，提取分离蛋白成分；

(2)测定蛋白浓度；

(3)质谱前处理：包括进行全蛋白溶液的消化和脱盐；

(4)LC-MS-MS分析：将上一步经消化和脱盐吹干的样品通过使用纳升液质系统的反相液相色谱得到的肽段产物，并通过使用LTQ-Orbitrap质谱仪的串联质谱法通过纳升离子源进行分析；

(5)数据库搜索：使用MaxQuant_1.5.8.3软件分别搜索来自30个单独的鸟枪法LC-MS/MS运行的原始光谱文件；