[发明专利]NTDs鼠胚动物模型及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物模型的构建方法，特别是涉及一种NTDs鼠胚动物模型的构建方法，以及利用该方法构建的NTDs鼠胚动物模型和细胞模型。

背景技术

神经管畸形(neural tube defects, NTDs)是人类最主要的出生缺陷疾病，发病率排在第二位。

NTDs是由于在胚胎发育过程中，神经管闭合不全引起的一类先天畸形，主要表现是脑和脊髓的异常，临床上以先天性无脑畸形和脊柱裂常见，但其发病机制尚不清楚。

全球有每年300000新生儿罹患，发病率约为0.5～2‰。发展中国家发病率更高，在山西省的某些地区高达13.9‰，严重影响人口质量的同时，也给社会和家庭带来了沉重的负担。

神经管发生是胚胎早期一个重要的涉及中枢神经系统原基形成的发育学事件，从单侧神经上皮细胞构成的神经板逐渐演变为长管状神经管的过程称为神经胚形成。神经管闭合包含四个有序而重叠的阶段，即神经板形成、神经板塑形、神经板卷褶和神经褶融合，其中任何一个环节受到干扰，都会导致NTDs的发生。

人NTDs标本来源有限，构建NTDs动物模型有助于深入认识人类NTDs的病因、发病机制和病理特点，对研究防治措施具有重要意义。鼠类与人的神经管发育模式非常相似，所以是目前研究NTDs最常见的模式生物。

NTDs是遗传和环境因素共同作用的结果。现有NTDs动物模型的构建方法主要包括基因敲除和环境诱导两种方式。

目前在小鼠中已经发现了超过200个基因可导致NTDs表型，但这些基因在人群中却没有得到很好的验证。

环境因素对于神经管闭合具有深远的影响，叶酸能有效预防NTDs就是很好的证据。但近年来研究发现，30～50%的NTDs是不能通过叶酸来预防的。因此，其他的环境因素也应该引起重视。目前已构建了妊娠期高温、高糖以及一些化学因素(如顺铂、环磷酰胺、丙戊酸等)诱导的NTDs鼠胚模型，以用于NTDs发病机制的研究。

由于环境因素复杂多样，研究不同环境对于NTDs发生的影响具有重要意义。维生素A在女性生殖和胚胎发育中具有重要作用，其在NTDs发生中的作用及机制值得探讨，建立相应的NTDs模型，将会为相关研究提供良好的平台。

发明内容

本发明的目的是提供一种NTDs鼠胚动物模型及其构建方法，以利用所构建的鼠胚动物及细胞模型深入研究NTDs的发生机制。

本发明具体是提供了一种采用维甲酸干预以构建NTDs鼠胚动物模型的方法。维甲酸是维生素A在体内的活性衍生物，其在体内的分布对胚胎发育具有重要的调节作用。维甲酸代谢紊乱可以引起鼠胚发育异常，本发明发现，维甲酸干预能够快速诱导构建稳定高效的NTDs鼠胚动物模型。

本发明所述NTDs鼠胚动物模型的构建方法是：使用正常孕鼠，在孕6～10天时一次性给予剂量19～23mg/kg的维甲酸进行灌胃干预，孕10.5天后得到NTDs鼠胚动物模型。

进一步地，所述维甲酸的最佳干预剂量为21mg/kg。

孕6～10天是鼠胚神经管发育的关键阶段，在这个阶段，以合理剂量的维甲酸进行干预，能够成功得到NTDs鼠胚动物模型。

优选地，构建NTDs鼠胚动物模型的最佳维甲酸干预时间是孕7.5天。

本发明将小鼠按照一定的雌雄比例合笼得到孕鼠后，采用上述方法进行维甲酸药物干预，并以采用等体积香油干预的孕鼠作为对照。规定孕周时在体视显微镜下观察鼠胚发育情况，对照孕鼠鼠胚发育正常，药物干预孕鼠的鼠胚发育异常，出现明显的发育迟缓、神经管闭合障碍，主要表现为脑部畸形。证明本发明方法能够快速稳定的构建成功NTDs鼠胚动物模型。

进而，本发明还在NTDs鼠胚动物模型的基础上，进一步分离出鼠胚脑泡组织进行细胞培养，建立了NTDs细胞模型，并对其细胞增殖、细胞周期和细胞分化等特性进行了研究。利用本发明所构建的动物模型和细胞模型，可以为研究NTDs的分子和细胞机制提供良好的平台。

神经干细胞(neural stem cells, NSCs)具有增殖和自我更新能力，在特定条件诱因下，能够向各种类型神经元或神经胶质细胞分化，是神经系统形成和发育的基础，其增殖、凋亡和分化对于神经管的发育非常重要。本发明发现，维甲酸干预孕鼠的鼠胚发育过程中，可以引起鼠胚神经干细胞增殖及向神经元和神经胶质细胞的分化能力受损。