[发明专利]一种基于PiggyBac载体的CD‑19‑CAR‑T系统构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及CD-19-CAR-T系统构建技术，特别是涉及一种基于PiggyBac载体的CD-19-CAR-T系统构建方法。

背景技术

CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法)是近年来发展起来的新的过继免疫细胞治疗手段，通过基因工程手段修饰T细胞，使其表达嵌合抗原受体，嵌合抗原受体可以特异性识别肿瘤相关抗原靶点，识别结合后将激活增殖T细胞的信号传递至胞内，引起T细胞激活和增殖，从而有效杀伤肿瘤细胞。CAR分子大致可分为5代演变：I代，特异性T细胞激活；II代，增加共刺激因子，提高细胞毒性；III代，同时具有两个共刺激因子，提高T细胞增殖能力与杀伤毒性；IV代，整合自杀基因，精确调控，细胞因子释放(如IL-7，IL-15)激活等；V代，通用型CAR。与普通的免疫细胞治疗相比，CAR-T技术具有许多独特的优势，如CAR能非MHC依赖性识别肿瘤抗原，不需要经过APC。肿瘤表面蛋白类和脂类抗原都可以作为靶点；有共刺激分子，能有效增强T细胞增殖。因此该技术被认为是有望彻底攻克人类癌症的独特方法。

目前，CAR-T免疫治疗已在许多临床实验上取得巨大进展。其中，针对B相关抗原CD19阳性的B细胞恶性肿瘤，如急性B-淋巴细胞白血病(B-ALL)，慢性B-淋巴细胞白血病(B-CLL)，B细胞霍奇金氏淋巴瘤(B-HL)和非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)，CAR-T-CD19T细胞免疫治疗疗效显著，已有报告显示CAR-T-CD19治疗在成人和儿童复发和难治性B-ALL中可以获得高达90％的完全缓解率(Complete remission，CR)。研究报告也显示，几种用不同结构设计的CAR-CD19的临床试验治疗都显示了相似的良好疗效。有些患者经CAR-T治疗后还获得了持久性缓解，不需要额外的其他治疗。

尽管如此，该治疗仍有许多环节需要改进，如能否找到更好的受体、更好的载体、更好的协同刺激分子等，其中转染载体的安全性和有效性对于临床治疗尤为关键。现今，CAR主要的转染模式包括，慢病毒、逆转录病毒、电转染等方式，病毒载体尽管具有较好的转染效率，但存在因基因组整合引起插入突变的风险，因此，利用非病毒载体结合电转技术，不需要病毒的介入，可获得与病毒感染效率相当甚至更高的转染结果，避免了病毒核酸随机插入宿主细胞，影响细胞正常生长以及后续可能的病变，是提升CAR-T细胞疗法的安全性的重要环节。

PiggyBac(PB)系统是利用PB转座子特有的“剪切和粘贴”机制，使DNA片段在载体和基因组之间“自由”的转移，从而有效介导外源DNA片段对基因组的整合。转座时，转座酶有效的识别特异的转座子序列(ITRs)，与转座子末端结合形成短暂的发夹结构，“剪切”后脱离，“粘贴”至基因组的TTAA位点。作为一种新的转基因手段，PiggyBac系统具有许多优势：(1)、与病毒载体相比有安全性高、操作方便、成本低等优点；(2)、整合效率高及更高的目的基因表达概率；(3)、负载容量大，更大的目的片段的插入，可实现多基因的共表达；(4)、转基因可长期稳定地表达，转座后没有引起染色体重排等不稳定现象；(5)、更“精确”拷贝数的插入；(6)、再次转座后可自由移除插入片段，实现精确切离；(7)、可用非损伤性的可见标记代替PCR等传统方法在活体中跟踪转基因；(8)、宿主范围广，转座效率高，且基本不依赖于宿主因子。因此，PB转座系统不仅可作为哺乳动物及培养细胞的转基因工具，也是一种较为理想的非病毒类基因治疗载体。基于上述的优势，利用PiggyBac载体构建CD-19-CAR-T势在必行。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种基于PiggyBac载体的CD-19-CAR-T系统构建方法。

其采用的技术方案如下：