[发明专利]一种基于细菌增长对细菌快速镜检的方法

说明书

本发明设计并建立了一种基于细菌增长的用于镜检检测大肠杆菌与鼠伤寒沙门氏菌的新方法。通过向待测样品溶液中添加β‑内酰胺类抗生素使得细菌菌体增长，并联合膜过滤与磁分离实现对大肠杆菌与鼠伤寒沙门氏菌的特异性与高灵敏度检测，使得细菌数目在光学显微镜下即可得到判断，该方法可以应用到水样中，整个检测过程可在2小时内完成。经试验验证，本发明方法对大肠杆菌与鼠伤寒沙门氏菌两种细菌的检测限均可低至5个细胞，可以满足快速检测方法的要求。该方法操作简单，成本低，可广泛应用于实际样品中对革兰氏阴性菌的镜检检测中。

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，特别涉及一种基于细菌增长对细菌快速镜检的方法。

背景技术

由微生物引起的食品污染以及食源性疾病极大地威胁了公众的健康与食品行业的发展。全世界范围内，每年由食源性致病菌如大肠杆菌和沙门氏菌所引发的疾病危害极为严重。甚至很低的感染剂量都会导致严重的疾病。比如大肠杆菌与沙门氏菌的感染剂量可低至10个细胞。因此建立有效的检测方法检测细菌的数目尤为重要。

传统的平板培养方法是当前细菌检测的国家标准方法，但是该方法操作繁琐，耗时较长，无法满足快速检测的要求。酶联免疫吸附试验，聚合酶链式反应以及表面增强拉曼光谱等检测方法具有灵敏度高，快速，特异性强等优点，但是仪器操作较复杂，花费成本比较高，需要复杂的样品处理过程。不适用于现场检测。而且当细胞数量低于100时，快速检测方法的准确度不高。显微镜观察是比较直观的方法，能从视觉上判断细菌的数目。该方法操作简单，成本花费较少，不需复杂的样品处理过程。但是细菌长度一般小于5μm，难以清晰地将其与杂质分辨。因此建立一种基于显微镜的检测方法以实现在单细胞水平上对细菌的快速检测成为本领域亟待解决的问题。

发明内容

β-内酰胺类抗生素可以通过抑制或诱导青霉素结合蛋白(penicillin bindingproteins,PBPs)产生突变，影响细胞壁中肽聚糖的聚合作用，使细菌胞壁缺损，菌体膨胀裂解。基于此，发明人在研究中发现，通过抗生素的适当处理，革兰氏阴性菌的细胞分裂过程被抑制，但是细胞长度会一直增加呈丝状直到细胞溶解，而在此过程中，增长后的细菌可以在显微镜下清晰地看到。基于此，发明人提出一种基于细菌增长实现对细菌快速镜检的方法，该方法操作简单，耗时短，灵敏性高，特异性好，不需要昂贵复杂设备，成本低廉，适于对细菌镜检的实际应用。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，公开了β-内酰胺类抗生素在细菌快速镜检中的应用。

其中，β-内酰胺类抗生素包括但不限于青霉素及其衍生物、头孢菌素、单酰胺环类、碳青霉烯类和青霉烯类酶抑制剂，优选的，所述β-内酰胺类抗生素包括头孢氨苄，氨曲南和阿莫西林；更进一步优选的，所述β-内酰胺类抗生素为氨曲南，所述氨曲南添加浓度为1～100倍最小抑菌浓度(优选为1倍最小抑菌浓度)；试验表明，氨曲南在1倍最小抑菌浓度时可最大程度上引起大肠杆菌与鼠伤寒沙门氏菌菌体增长，而不致使待测菌体快速溶解，有利于后续镜检；

所述细菌为革兰氏阴性菌，进一步的，所述细菌为大肠杆菌和/或鼠伤寒沙门氏菌；

所述应用具体方法为：将β-内酰胺类抗生素添加至待测细菌中，促使细菌菌体伸长，便于在显微镜下镜检观察。

进一步的，所述应用具体方法为：将氨曲南以终浓度为1倍最小抑菌浓度添加至大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌菌液中。

本发明的第二个方面，公开了一种基于细菌增长对细菌快速镜检的方法，具体包括步骤如下：

S1.向待测样品中添加β-内酰胺类抗生素和抗体修饰磁球进行孵育处理，其中，β-内酰胺类抗生素促使待测细菌菌体伸长，便于后续在显微镜下镜检观察；抗体修饰磁球与伸长后的细菌偶联；