[发明专利]一种用于检测猕猴桃溃疡病菌PSA3的多克隆抗体及其应用

说明书

本发明提供hopZ5基因在检测猕猴桃溃疡病菌PSA3中的用途，提供一种基于hopZ5基因的用于检测猕猴桃溃疡病菌PSA3的多克隆抗体，并提供含有所述多克隆抗体的免疫胶体金试剂盒及其应用。本发明的PSA3多克隆抗体具有检测特异性高和适用范围广的特点；提供的猕猴桃溃疡病菌PSA3点免疫反应和免疫胶体金试纸条，检测方法简单，能同时检测大量样品，具有在基层推广和应用的价值。

【技术领域】

本发明涉及免疫分析，特别涉及一种用于检测猕猴桃溃疡病菌PSA3的多克隆抗体、含有所述抗体的免疫胶体金试纸条，以及应用所述抗体的猕猴桃溃疡病菌PSA3的检测方法。

【背景技术】

猕猴桃溃疡病是猕猴桃产区的第一大病害，于1984年日本静冈县首次发现，随后在中国、韩国、意大利、法国、葡萄牙、西班牙、新西兰和智利等多个国家陆续报道。中国主要分布于陕西、四川、河南、贵州等省，目前，四川都江堰、雅安、苍溪等地发病均较严重，很多果园已造成毁园。造成该病害的病菌为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringae pv.actinidiae,PSA)，该菌适应性广、致病力强、来势凶猛，发病严重时，整株枯死，几年间可造成毁园。近年来，随着猕猴桃溃疡病感病品种种植区域的不断扩大，苗木繁育和调运不规范，防治困难等因素的影响，使得猕猴桃溃疡病的发生、传播和蔓延进一步扩大，已成为猕猴桃的毁灭性病害，是生产上亟待解决的重大问题之一。

近些年的研究报道证实猕猴桃溃疡病菌具有一个重要特性——潜伏侵染。因此，田间带菌果树的早期诊断是防治猕猴桃溃疡病的关键；对调运苗木的准确检测是防治其蔓延的关键。建立快速、方便、准确的检测方法，对于猕猴桃溃疡病的防治具有重要意义。

目前，猕猴桃溃疡病菌主要通过分子生物学检测，其中PCR检测具有准确、灵敏的优势。依据细菌所特有的喷菌现象，很多细菌病害通过带菌组织浸泡液直接进行PCR检测，较为方便快捷。例如中国发明专利申请CN 201611158141.1公开了一种定量检测猕猴桃溃疡病菌的实时荧光PCR方法，其统括特异性引物扩增、对扩增产物进行测序比对，根据序列的比对结果判断样品感染情况。

然而，作为待测样品的猕猴桃枝干、叶片等组织在浸泡时，各种次生代谢产物尤其是多糖、多酚从组织中浸泡出，对PCR反应及其它检测方式造成干扰，使得这种简单的制样方法对猕猴桃溃疡病菌检测不适用。可见，猕猴桃组织的制样方式是后续检测结果是否稳定的前提，优化及简化制样过程，是改善目前猕猴桃溃疡病菌检测的重要环节。此外，鉴于PCR检测受限于所需仪器和操作环境等条件杂，对于基层部门仍旧存在限制，因此，有必要开发其它检测方法，进而适于不同的领域和部门。

根据记载，目前已知PSA分为5个类群。其中，PSA1分布于日本；PSA2只存在韩国；PSA3广布于全球，包括2008-2009年意大利爆发的猕猴桃溃疡病、中国、智利、新西兰、韩国等，PSA3是造成全球猕猴桃产业重大损失的类群；PSA4分布于新西兰和澳大利亚。此外，Fujikawa等利用基因组学确认了PSA5类群，目前仅在日本发现，且PSA4和PSA5属于低毒类群。本发明针对PSA中分布广并造成严重危害的类群PSA3，通过分析各类群致病因子差异，包括效应子差异，期望找出仅PSA3类群特有的效应子，制备了一种PSA3多克隆抗体，并提供了简单的血清学检查方法。

【发明内容】

本发明的目的是克服现有技术缺陷，提供获得一种PSA3类群特有的效应子，从而获得一种用于检测猕猴桃溃疡病菌PSA3的多克隆抗体，并借助该抗体实现PSA3类群的快速、方便、高效的血清学工具，进而为猕猴桃溃疡病的早期防治和限制带菌苗木的扩散提供依据。

为了实现上述目的，发明人对已报道PSA全基因组测序结果进行挖掘，对比PSA各类群基因差异、尤其是效应子差异，提供了hopZ5基因在检测猕猴桃溃疡病菌PSA3中的用途。