[发明专利]检测Kras基因第12、13密码子突变位点的方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种检测Kras基因第12、13密码子突变位点的方法，该方法不包括疾病的诊断和治疗方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取样本DNA，将其作为DNA模板；

2）利用一组ARMS引物、一个如SEQ ID NO.17所示的荧光探针和一个如SEQ ID NO.18所示的封闭探针，对步骤1）的DNA模板进行荧光PCR扩增；所述一组ARMS引物的上游引物由SEQID NO.1-8所示序列组成，其下游引物为如SEQ ID NO.9所示序列；所述荧光探针为特异性双环分子信标荧光探针；所述步骤2）中，荧光PCR扩增的总体积为40μl的反应体系如下：

2×Premix Ex Taq (Probe qPCR) 20μl

RoxⅠ（50×） 0.8μL

各条引物 0.005～1.0μmol

探针 0.001～1.0μmol

10ng/μl DNA模板 1.0～5.0μl

水补足至40μl；

步骤2）中，所述荧光PCR扩增的反应条件如下：

96℃预变性3分钟，12个循环，95℃变性15秒，70℃退火延伸20秒，64℃退火延伸20秒，72℃延伸10秒；35个循环，95℃变性15秒，70℃退火延伸20秒，64℃退火延伸34秒，72℃延伸10秒；并且35个循环在退火时，检测FAM荧光信号；

3）检测荧光PCR扩增中的反应体系的荧光强度，并根据荧光强度达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值来判断Kras基因第12、13密码子突变位点的突变；所述步骤3）中，判断Kras基因第12、13密码子突变位点的突变的标准为：

检测荧光PCR扩增中的反应体系的FAM荧光信号，以质控基因FAM荧光信号达到设定阈值时，表明上样DNA量在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，Ct值大于等于35：阴性；Ct值小于35：阳性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，所述样本包括：新鲜组织样本、石蜡包埋组织切片样本；

步骤2）中，所述荧光探针的5’端和3’端分别连接有荧光基团和淬灭基团；其中，荧光基团包括：FAM、HEX、CY5和ROX；淬灭基团包括：BHQ、Eclipse 和TAMRA。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述荧光基团为FAM或ROX；所述淬灭基团为BHQ。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2）中，还包括：利用如SEQ IDNO.21-22所示的质控基因引物和SEQ ID NO.23所示的质控基因探针对步骤1）的DNA模板进行荧光PCR扩增。

5.一种用于如权利要求1～4任一项所述的方法的检测试剂盒，其特征在于，包括：一组ARMS引物，其上游引物由SEQ ID NO.1-8所示序列组成，其下游引物为如SEQ ID NO.9所示序列；一个如SEQ ID NO.17所示的荧光探针和一个如SEQ ID NO.18所示的封闭探针。

6. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：如SEQ ID NO.21-22所示的质控基因引物和SEQ ID NO.23所示的质控基因探针。

7. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)。