[发明专利]一种界面自组装羰基还原酶的制备及在S-利卡西平合成中的应用

权利要求书

1.一种界面自组装羰基还原酶，其特征在于所述界面自组装羰基还原酶按如下方法制备：将羰基还原酶加入pH 6.5、0.02M的Tirs-HCl缓冲液中，再加入溶解有聚苯乙烯的甲苯溶液，在黑暗、80r/min、30℃条件下在摇床中震荡反应2小时，将反应液转移至离心管中1000rpm离心20min，形成上层为有机相、中间层为界面自组装羰基还原酶、下层为水相的体系，去除水相和有机相，获得界面自组装羰基还原酶；所述羰基还原酶加入量以缓冲液体积计为20～200U/ml，所述聚苯乙烯的甲苯溶液浓度为1.0～4.0g/L，所述聚苯乙烯的甲苯溶液与缓冲液体积比为1-3:1。

2.如权利要求1所述界面自组装羰基还原酶，其特征在于所述羰基还原酶酶活为180U/mg。

3.如权利要求1所述界面自组装羰基还原酶，其特征在于所述羰基还原酶按如下方法制备：(1)将Bacillus anthracis CGMCC No.12337分散于pH 6.5、0.02M的Tris-HCl缓冲液中，置于0～4℃冰水浴中，在功率400W、超声2s、间歇4s的条件下超声破碎20min，破碎混合液8000r/min离心10min，获得上清液，即为粗酶液Ⅰ；(2)将粗酶液Ⅰ置于冰水浴中预冷至0～4℃，搅拌的同时缓慢加入硫酸铵粉末至硫酸铵质量饱和度为40％，硫酸铵完全溶解后，冰水浴缓慢搅拌1h，于10000r/min离心10min，上清液继续添加硫酸铵直至质量饱和度为60％，冰水浴缓慢搅拌1h，于10000r/min离心10min得沉淀，将所得沉淀重新溶解于1～2倍沉淀体积的pH 6.5、0.02M的Tris-HCl缓冲液中，得粗酶液Ⅱ；(3)将粗酶液Ⅱ加入10kDMilipore超滤离心管中，在3500r/min，4℃的条件下离心20min，套管中的浓缩液即为羰基还原酶酶液。

4.如权利要求1所述界面自组装羰基还原酶，其特征在于所述羰基还原酶加入量以缓冲液体积计为144U/ml，所述聚苯乙烯的甲苯溶液浓度为3.75g/L，所述聚苯乙烯的甲苯溶液与缓冲液体积比为1.6:1。

5.一种权利要求1所述界面自组装羰基还原酶在不对称还原奥卡西平制备S-利卡西平中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用方法为：以界面自组装羰基还原酶为催化剂，以奥卡西平为底物，以NADH为辅酶，以乙醇为辅助底物，加入乙醇脱氢酶用于辅酶NADH的原位再生，以pH3.0～8.0的Tris-HCl缓冲液与甲苯形成的Tris-HCl/甲苯两相体系为反应介质，在20～40℃、80r/min的摇床中反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得所述的S-利卡西平；所述催化剂用量以缓冲液体积计为5～150U/mL，底物用量以缓冲液体积计为1.98～9.52mmol/L，所述乙醇体积用量以缓冲液体积计分别为1～10％；所述NADH用量以缓冲液体积计为0.02～0.1mol/L，所述乙醇脱氢酶用量以缓冲液体积计为3000-120000U/L，所述甲苯与缓冲液体积比为2.5-20:10。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述催化剂用量以缓冲液体积计为36U/mL，底物用量以缓冲液体积计为3.97mmol/L，所述乙醇体积用量以缓冲液体积计为6％；所述NADH用量以缓冲液体积计为0.08mol/L，所述乙醇脱氢酶用量以缓冲液体积计为6000U/L，所述甲苯与缓冲液体积比为选12.5:10。