[发明专利]促小麦生长的茎瘤固氮根瘤菌及其构建和应用

说明书

本发明涉及农业微生物领域，具体地说是一种小麦促生茎瘤固氮根瘤菌及其构建和应用。本发明菌株具有良好的固氮、定植与促生特性，可以增加土壤养分，提高肥料有效性，促进植物对土壤养分吸收，具有开发成促进农作物生长的微生物接种剂或微生物菌肥的良好前景。本发明针对小麦具有显著的促生效果，菌株良好地促生特性促进了小麦生长。

技术领域

本发明涉及农业微生物领域，具体地说是一种小麦促生茎瘤固氮根瘤菌及其构建和应用。

背景技术

小麦为禾本科植物，是我国最主要的粮食作物之一，播种面积达粮食作物总面积的22％，小麦产量达到粮食总产量的20％以上。小麦作为我国主要的商品粮和贮备粮品种，在对稳定我国经济发展趋势和促进人民生活水平提高上有重要意义。

当前，我国土地资源匮乏，并伴随着全球气候异常、灌溉设施落后等土地资源的不合理利用方式，导致土壤盐碱化程度不断加深，此外，我国占全球8％的耕地消耗了世界30％以上的化肥，长期的过度施肥带来环境污染、土壤板结、生态恶化和农产品品质下降等一系列问题。因此，适应绿色农业以及农业可持续发展的需求，开发利用替代化学肥料的新肥源成为当务之急。

植物根际促生菌是指生存在根际土壤或附生于根表、根内，并可直接或间接促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌类。接种根际促生菌，不但能够减少化肥农药的使用，也能减轻因大量使用化肥农药而造成的环境污染和食品安全问题。促生菌茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans ORS571)属于杆菌，其细胞直径大于2.0μm且长短不一，呈卵圆状或类球状，其宿主特异性很强，目前只发现与毛萼田菁(Sesbania rostrata)形成共生结构。该菌不同于其它根瘤菌，除了可以与豆科宿主毛萼田菁共生固氮，还可自生或作为内生菌在其他植物的体内联合固氮。目前，人们已经对茎瘤固氮根瘤菌对小麦的促生作用和互作机制进行了研究，并证实其可被应用于农业，尤其是小麦生产。

发明内容

本发明目的在于提供一种小麦促生茎瘤固氮根瘤菌及其构建和应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种促小麦生长的茎瘤固氮根瘤菌，茎瘤固氮根瘤菌为敲除趋化基因cheZ的茎瘤固氮根瘤菌。其中，出发菌株可为ORS571。

一种促小麦生长的茎瘤固氮根瘤菌的构建方法，：

(1)分别扩增茎瘤固氮根瘤菌cheZ基因上游的cheZ-Up和下游的cheZ-Down片段；

(2)构建敲除表达重组质粒pCM351::Up-Down。

(3)将上述获得重组质粒通过三亲结合导入茎瘤固氮根瘤菌(出发菌株)；

(4)使用分别含有庆大霉素和四环素抗性的TY固体培养基筛选阳性结合子，并通过PCR验证获得茎瘤固氮根瘤菌趋化基因cheZ敲除的茎瘤固氮根瘤菌株。

所述将上述获得重组质粒通过三亲结合导入茎瘤固氮根瘤菌为将茎瘤固氮根瘤菌、含有重组质粒的DH5α供体菌和含有辅助质粒pRK2013的DH5α辅助菌在LB固体培养基，37℃条件下培养48h进行三亲结合。

具体为：

将上述获得重组质粒通过三亲结合导入茎瘤固氮根瘤菌为将茎瘤固氮根瘤菌、含有重组质粒的DH5α供体菌和含有辅助质粒pRK2013的DH5α辅助菌分别在TY和LB液体培养基中37℃条件下过夜培养。将受体菌、供体菌和辅助菌分别按照1ml、200ul、300ul的比例进行混合，3500rpm离心3min，倒掉上清，将剩余约50ul混合菌液悬滴到LB固体培养基，37℃条件下培养48h进行三亲结合。