[发明专利]猪CD4基因功能突变位点分子育种标记的鉴定及应用

说明书

本发明提供了猪CD4基因功能突变位点分子育种标记的鉴定及应用。具体地，本发明提供了CD4基因的4个功能突变位点，所述的4个突变位点影响CD4基因的表达水平、膜定位以及免疫水平。该分子标记的4个关键突变位点特征为在CDS区域第193(A/G)、195(G/C)、196(A/G)、202(C/G)位碱基处存在突变。本发明为猪免疫性状的标记辅助选择提供了新的分子标记。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地涉及猪CD4基因功能突变位点分子育种标记的鉴定及应用。

背景技术

规模化养殖的优势在于可以降低养殖成本，使养殖走向标准化，食品安全更有保障。面对疫病挑战，养猪人往往会做出两种选择：大剂量使用抗生素和频繁接种各种疫苗。虽然抗生素能够杀死大部分有害菌，但是耐药性、药物残留等问题不容忽视。频繁接种疫苗不但增加养殖成本，而且容易对猪造成应激。因此，在饲养环节做好饲料质量把控、猪场及饲养人员消毒管理、疾病防疫等工作尤为重要。此外，还可以从根源上寻找途径，培育抗病新品系，减少疾病发生的机会，这从长远看不仅降低养殖成本，还可以改善猪肉食品环境。

机体的免疫系统能够抵抗细菌、病毒等抗原而使机体免于疾病伤害，免疫系统分为固有免疫(非特异性免疫)和适应性免疫(特异性免疫)，适应性免疫又分为体液免疫和细胞免疫。CD₄⁺T细胞作为一类重要的免疫细胞，其在体液免疫和细胞免疫中发挥重要作用。

CD(Cluster of Differentiation)是位于淋巴细胞表面一类分化抗原的总称。CD4为表达于淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等免疫细胞表面的单链糖蛋白。CD4胞外区通过与MHCII类分子的结合来稳定TCR与抗原肽-MHCII类分子复合物；CD4的胞内区通过半胱氨酸基序招募Lck聚集于TCR中间形成大分子簇，使得TCR-CD3上的ITAM(ImmunoreceptorTyrosine-based Activation Motif)得以被Lck磷酸化从而启动信号传导过程。

已有研究报道CD4基因的突变和免疫疾病、病毒感染相关。人CD4基因启动子区3个碱基的突变和I型糖尿病的发生有关；CD4基因增强子区域的2个碱基突变与类风湿性关节炎有关；CD4分子作为HIV-I的主要受体，研究发现CD4D1区的突变可以改变其与HIV-I的亲和力；猕猴CD4基因上第39位的氨基酸突变可能与其对HIV病毒具有抵抗力有密切关系。

基于CD4基因在免疫调节中的重要性，其可以作为猪抗病育种的候选基因，但是目前对于猪CD4基因的功能突变研究仍未见报道。因此，本领域迫切需要对猪CD4基因的功能突变研究

发明内容

本发明的目的在于提供猪CD4基因4个功能突变位点的鉴定及应用。

具体地，申请人通过GWAS(Genome Wide Association Study)的方法，对杜洛克×二花脸F2群体的T细胞亚群(CD₄⁺T％)和60K基因芯片(Illumina,USA)进行了分析，分析发现CD4基因位于该性状的候选区域内，具体结果见附图2。

申请人通过基因克隆的方法，利用如下引物对：

正向引物：CTCGGCAAAACCACAATG(见序列表SEQ ID NO:3)

反向引物：GGAAAAGGGAAAGAGGAAGAAAG(见序列表SEQ ID NO:4)；

对杜洛克×二花脸F2群体的cDNA进行CD4基因的PCR扩增，测序分析得到两种单倍型，单倍型的序列见序列表SEQ ID NO:1(单倍型A)和SEQ ID NO:11(单倍型B)。申请人再在得到的两种单倍型序列基础上，利用突变引物对进行扩增，扩增得到D1区部分位点突变的序列，将扩增得到的片段连接重组后插入超表达载体pEGFP-n1中。