[发明专利]一种长片段DNA体外重排的方法

权利要求书

1.一种长片段DNA体外重排的方法，其特征在于，包括：

步骤1、在包含有2个以上功能基因的长片段DNA的每个功能基因的5’和3’两端，各插入一段SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，获得待重排的长片段DNA；

步骤2、将待重排的长片段DNA连接到带有筛选标签的质粒上，获得待重排的质粒；

步骤3、将待重排的质粒、Cre酶、Cre酶缓冲液和ddH₂O混合开启重排，然后使Cre酶失活关闭重排，获得DNA重排的质粒文库；

步骤4、将DNA重排的质粒文库转化到出发菌株并进行培养，以出发菌株为对照，选择菌落较大、颜色和对照菌落成显著差异的菌落作为潜在的优势表型菌落，提取其中的DNA重排的质粒，对质粒上的重排后的长片段DNA进行分析。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述筛选标签为营养缺陷标签或抗性标签。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述营养缺陷标签为氨基酸缺陷标签。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述氨基酸缺陷标签选自URA、LEU和HIS。

5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述抗性标签选自KanMX、NAT和Hyg。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1为：

在由tHMG1、crtI、crtE和crtYB四个功能基因组成的长片段DNA的每个功能基因的5’和3’两端，各插入一段SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，获得待重排的长片段DNA。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3为：

将待重排的质粒、Cre酶、Cre酶缓冲液和ddH₂O混合，于37℃反应60min，然后在70℃失活10min，获得DNA重排的质粒文库。

8.根据权利要求1或7所述方法，其特征在于，每20μL体系，将500ng待重排的质粒、2μL Cre酶、2μL Cre酶缓冲液和余量ddH₂O混合，于37℃反应60min，然后在70℃失活10min，获得DNA重排的质粒文库。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤4为：

将DNA重排的质粒文库转化到出发酵母菌株中并进行培养，以出发酵母菌株为对照，选择菌落较大、颜色为与对照菌落形成显著差异的橙色或黄色的菌落，作为潜在的优势表型菌落，提取其中的DNA重排的质粒并反转至大肠杆菌中，从大肠杆菌中提取质粒，利用实时定量荧光PCR或第三代测序技术对质粒上重排后的长片段DNA进行分析。

10.根据权利要求1或9所述方法，其特征在于，所述长片段DNA由tHMG1、crtI、crtE和crtYB四个功能基因组成，该长片段DNA能够使酵母菌株生产β-胡萝卜素。