[发明专利]PCR-ELISA法检测家蚕微孢子虫的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.PCR-ELISA法检测家蚕微孢子虫的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含核酸分子标记物标记的检测家蚕微孢子虫的引物对，检测所述核酸分子标记物的ELISA试剂和样品处理试剂；所述引物对的序列如SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.43与SEQ ID NO.44，SEQ ID NO.49与SEQ ID NO.50，SEQ ID NO.75与SEQ ID NO.76或SEQ ID NO.77与SEQ IDNO.78所示；检测所述核酸分子标记物的ELISA试剂包括浓度如下的组分：1µg/mL链霉亲和素、含体积分数为2%胎牛血清的PBS溶液、酶标DIG抗体、PBST溶液、体积分数为30%的H₂O₂、500mM草酸；

所述样品处理试剂包括质量分数10%的KOH，STP裂解液，直径425-600μm的玻璃珠，20mg/mL 蛋白酶K，质量分数10%的 SDS，酚：氯仿：异戊醇体积比为25:24:1的混合液，和无水乙醇；所述STP裂解液各组分浓度如下：质量分数1% SDS，质量分数1% 的Triton X-100和质量分数 1%的Nonidet P 40。

2.根据权利要求1所述PCR-ELISA法检测家蚕微孢子虫的试剂盒，其特征在于：所述核酸分子标记物为生物素和地高辛。

3.权利要求1~2任一项所述的试剂盒在非疾病诊断中检测家蚕微孢子虫的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）样品处理：

a.取蚕卵，加入质量分数为10%的 KOH处理使卵壳充分软化；

b.加入STP裂解液，并加入直径425-600μm的玻璃珠，放入孢子破碎仪中，破碎三次，每次5min；所述STP裂解液各组分浓度如下：质量分数1% SDS，质量分数1% 的Triton X-100和质量分数 1%的Nonidet P 40；

c.1000rpm离心2min，将上清转移至离心管中；

d.加入浓度为 20mg/mL的蛋白酶K和质量分数 10%的SDS，55℃处理30min；

e.加入酚：氯仿：异戊醇体积比为25:24:1的混合液充分混匀后，于12000rpm离心5min，吸取上清置于离心管中，并重复此步骤；

f.向上清液中加入无水乙醇，上下颠倒两次后12000rpm离心5min；

g.充分倒掉液体，倒置于吸水纸上，静置5 min，加入双蒸水使DNA溶解制得待检测样品模板；

（2）将经步骤（1）处理的获得待检测模板用核酸分子标记物标记的检测家蚕微孢子虫的引物对进行PCR扩增，所述引物对的序列如SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.43与SEQ ID NO.44，SEQ ID NO.49与SEQ ID NO.50，SEQ ID NO.75与SEQ ID NO.76或SEQ IDNO.77与SEQ ID NO.78所示；

（3）将步骤（2）扩增后的产物进行ELISA，检测在405nm处OD值，检测健康蚕卵基因组为模板的扩增产物为阴性样本，OD值大于阴性对照OD值2.1倍的样本即为阳性样本；OD值小于阴性对照OD值2.1倍的样本即为阴性样本。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述PCR扩增条件为98 ℃预变性2 min，98 ℃变性10 sec，64 ℃退火15 sec，68 ℃延伸35 sec，扩增30个循环；最后68℃延伸3 min。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述ELISA检测具体步骤如下：

a）酶标板每孔加入1 µg/mL的链霉亲和素溶液，4 ℃过夜或18~25 ℃处理3 h；

b）甩干板内液体，每孔加入PBST，震荡5 min，甩干板内液体，重复四次；

c）将PCR产物用含体积分数为2%胎牛血清的PBS溶液稀释50倍后加入酶标板，每个样品三个重复，18~25 ℃孵育2 h；

d）甩干板内液体，每孔加入PBST，震荡5min，甩干板内液体，重复四次；

e）加入用含体积分数为2%胎牛血清的PBS溶液按1:1000稀释的酶标DIG抗体稀释液，18~25 ℃孵育45 min；

f）甩干板内液体，每孔加入PBST，震荡5 min，甩干板内液体，重复四次；

g）加入体积比为1:1000的体积分数30%的 H₂O₂和 PBST溶液，避光孵育15min；

h）加入浓度500mM 的草酸溶液进行终止，并在405nm测定OD值。