[发明专利]一种体外快速优化菌株代谢通路的方法

权利要求书

1.一种体外快速优化菌株代谢通路的方法，其特征在于，包括：

步骤1、由商业载体pUC19出发，通过overlap PCR扩增出由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列、BsaI酶切位点、RFP、BsaI酶切位点、SEQ ID NO:1所示核苷酸序列顺次拼接的DNA序列，然后将该DNA序列插入到pUC19质粒多克隆位点处组装成为供体质粒，该供体质粒可以将外源基因利用RFP两端的BsaI酶切位点快速替换RFP基因，从而快速添加筛选标签1和功能基因片段，在构建的供体质粒基础上，利用Golden Gate组装方法，将功能基因片段与筛选标签1两端快速添加SEQ ID NO:1所示核苷酸序列之间；

步骤2、将各功能基因片段与含有筛选标签2和SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的接收载体、Cre酶、Cre酶缓冲液和ddH₂O混合构成反应体系，温控开启重排，然后使Cre酶失活关闭重排，获得重排的质粒文库；

步骤3、将重排的质粒文库转化到出发菌株中，在步骤1所述筛选标签对应的培养基上进行培养，选择与出发菌株相比颜色差异明显、菌落较大的菌株作为潜在高产菌株并测定代谢通路对应的化学品产量，确定正确高产菌株；

步骤4、提取正确高产菌株的重排质粒进行结构分析，获得优化后代谢通路的信息；

所述代谢通路的各功能基因为生产β-胡萝卜素的代谢通路的各功能基因、生产番茄红素的代谢通路的各功能基因或生产紫色杆菌素的代谢通路的各功能基因；

所述生产β-胡萝卜素的代谢通路的各功能基因为tHMG1、crtI、crtYB、crtE、ERG10、ERG12、ERG8、ERG19、ERG20、BTS1和ERG13。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2为：将各功能基因片段与含有loxPsym序列和筛选标签2的接收载体、Cre酶、Cre酶缓冲液和ddH2O混合构成反应体系，于37℃反应60min开启重排，然后70℃使Cre酶失活10min关闭重排，获得重排的质粒文库。

3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述反应体系中功能基因片段、含有loxPsym序列和筛选标签2的接收载体、Cre酶、Cre酶缓冲液和ddH₂O的用量分别为200ng／功能基因片段、400ng接收载体、1uL Cre酶、5uLCre酶缓冲液，补足ddH₂O至50uL。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述供体质粒为pYW0120质粒，所述pYW0120质粒由商业载体pUC19出发，通过overlap PCR扩增出由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列、BsaI酶切位点、RFP、BsaI酶切位点、筛选标签URA基因、SEQ ID NO:1所示核苷酸序列顺次拼接的DNA序列，然后将该DNA序列通过酶切连接的方法插入到pUC19质粒多克隆位点处组装成为供体质粒。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述接收载体为pYW0113质粒，所述pYW0113质粒是在商品质粒pRS413基础上，通过在多克隆位点用酶切连接的方法，引入overlap PCR扩增的由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列、RFP基因、SEQ ID NO:1所示核苷酸序列顺次拼接成的DNA序列获得。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述筛选标签1和2均为营养缺陷标签或抗性标签。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述营养缺陷标签为氨基酸缺陷标签。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述氨基酸缺陷标签选自URA、LEU和HIS。

9.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述抗性标签选自KanMX、NAT和Hyg。