[发明专利]一种溶酶体内酸性水解酶活性的检测方法和检测试剂盒

权利要求书

1.一种溶酶体内酸性水解酶活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有4甲基伞形酮荧光基团的底物溶液与待测水解酶溶液孵育，水解酶水解底物释放出荧光基团；对于硫酸酯酶，将其水解有机硫酸酯底物使之游离出无机硫酸后形成一个新的不含硫酸基团的底物化合物，该底物用另一种水解酶水解，通过添加一定量的水解酶，水解新形成的底物，释放荧光基团；测定反应在355nm处激发光下460nm出的发射光强度；根据荧光强度与荧光物质浓度的标准曲线关系，计算得到荧光物质浓度，通过荧光物质浓度与酶活性之间的标准曲线关系，计算得到待测水解酶溶液中水解酶的活性。

2.根据权利要求1所述的溶酶体内酸性水解酶活性的检测方法，其特征在于，具体操作步骤如下：

（1）将含有4甲基伞形酮荧光基团的底物溶液与待测水解酶溶液在37℃恒温条件下孵育1-17小时，底物溶液的PH为3.5-5.5；底物经水解酶水解后释放出荧光基团产生荧光，测定反应在355nm处激发光下460nm处的发射光强度；

对于硫酸酯酶，将含有4甲基伞形酮荧光基团的底物溶液与待测水解酶溶液在37℃恒温条件下孵育4-17小时，底物溶液的PH为3.5-5.5；其水解有机硫酸酯底物使之游离出无机硫酸后，形成一个新的不含硫酸基团的底物化合物；在反应体系内补充5-10ul浓度为500-1000ng/ul的人重组α-L-艾杜糖苷酶溶液或浓度为0.01-0.1U/ul的β-半乳糖苷酶溶液继续37℃恒温条件下孵育2-24小时，水解硫酸酯酶酶水解后的底物化合物并释放出荧光基团产生荧光；测定反应在355nm处激发光下460nm处的发射光强度；

（2）根据荧光强度与荧光物质浓度的曲线关系，计算得到荧光物质浓度，荧光标准曲线使用标准荧光物质4甲基伞形酮进行浓度梯度稀释至0-10nmol/ul，进行荧光检测，通过标准物质浓度梯度与荧光强度进行线性分析计算获得标准曲线方程；

（3）根据荧光物质浓度与酶活性之间的曲线关系，计算得到待测水解酶溶液中水解酶的活性，待测样本经荧光检测获得荧光强度，荧光强度数值通过荧光强度与荧光物质浓度的标准曲线方程计算出荧光物质浓度，通过荧光物质的摩尔浓度可以计算出被水解底物的摩尔浓度，计算单位时间内单位浓度蛋白中水解酶水解底物的量来代表酶活性数值。

3.根据权利要求2所述的溶酶体内酸性水解酶活性的检测方法，其特征在于，检测溶酶体酶活性的具体计算如下：

检测读取的待测样本荧光值为F样，实验中空白对照荧光值为F空，反应生成荧光物质的量为C，检测体积为V检，反应体积为V，蛋白质量为M；假设荧光标准曲线的线性方程为Y=a*X+b，其中Y为荧光物质的量，X为荧光强度读数，a和b为常数；

公式1：；

公式2：。

4.根据权利要求2所述的溶酶体内酸性水解酶活性的检测方法，其特征在于，所述水解酶为α-L-艾杜糖苷酶、β-半乳糖苷酶或芳基硫酸酯酶B酶；所说硫酸酯酶为艾杜糖醛酸硫酸酯酶、β-N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶。

5.根据权利要求4所述的溶酶体内酸性水解酶活性的检测方法，其特征在于，所述的水解酶为α-L-艾杜糖苷酶，底物为4-甲基伞形酮-α-L-艾杜糖苷；

所述的硫酸酯酶为艾杜糖醛酸硫酸酯酶，底物为4-甲基伞形酮-α-L-艾杜糖醛酸-2-硫酸酯二钠盐；

所述的硫酸为β-N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，底物为4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷-6-硫酸酯钠盐；

所述的水解酶为β-半乳糖苷酶，底物为4-甲基伞形酮-β-D-吡喃半乳糖苷；

所述的水解酶为芳基硫酸酯酶B酶，底物为4-甲基伞形酮基硫酸酯钾盐。