[发明专利]一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法

权利要求书

1.一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）氧化石墨烯的合成

称取12g的K₂S₂O₂和12g的P₂O₅加入到30mL浓硫酸溶液中，置于加热反应器上进行加热，当温度达到80℃时将5g石墨烯加入到浓硫酸溶液中进行反应，当溶液颜色变成深蓝色时停止加热，并将溶液冷却至室温；随后将溶液进行10倍稀释，并用0.22μm的滤膜进行过滤，除去大块的沉淀物收集滤液，然后置于80℃的条件下过夜干燥；将50mL的浓硫酸置于冰浴条件下冷却，随后加入2g前述处理的石墨烯氧化物，再加入10g的KMnO₄，在冰浴中搅拌反应20min后，加入2g的NaNO₃，在室温下搅拌反应2h，再加入500mL超纯水和30%的H₂O₂终止反应；得到的反应液用10%的HCl溶液洗涤后再用超纯水洗涤，随后再进行透析，将透析后的溶液进行超声剥离2h，最后将溶液在3000r/min的条件下进行离心除去离心管底部的沉淀，收集的上清液即为石墨烯氧化物；

（2）带有MMP-9切割位点的颈环杂交双链DNA的制备

将含有MMP-9切割位点的二肽DNA1偶联物以1.2:1的摩尔比与DNA2混合进行杂交反应，杂交缓冲液为pH8.0的0.05M Tris-HCl缓冲液，二肽DNA1偶联物的终浓度为12nM，DNA2

的终浓度为10nM，在室温下孵育0.5~2h后，得到带有MMP-9切割位点的颈环杂交双链DNA结构；

二肽DNA1偶联物：5’-ACCGTAGCGT-Gly-Leu-GGTCAACTGC-3’；

DNA2：5’-GCAGTTGACC-GTCTACCGTA-ACGCTACGGT-3’；

（3）荧光信号的测定以及MMP-9的检测

取100μL步骤（1）合成的石墨烯氧化物用0.01M pH7.6的HEPES缓冲液进行10倍稀释，得到浓度为1mg/mL的石墨烯氧化物，然后加入荧光染料标记的DNA3使得DNA3的终浓度为10~20nM，在室温下孵育20~60min，得到石墨烯氧化物荧光标记DNA3的混合体系；将步骤（2）制备的双链DNA反应物分装到250μL PCR管中，每管50μL，在每管中分别加入浓度为0nM、0.1nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM的MMP-9，在室温下振荡反应0.5~2h后，加入50μL前述制备的石墨烯氧化物荧光标记DNA3的混合反应液组成反应终体系，在室温下孵育反应20~50min，测定每管的荧光信号强度；

DNA3：5’-TACGGTAGAC-荧光染料-3’。

2.根据权利要求1所述的一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法，其特征在于所述的步骤（2）中二肽DNA1偶联物和DNA2的孵育时间为1h。

3.根据权利要求1所述的一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法，其特征在于所述的步骤（3）中荧光染料为FAM。

4.根据权利要求1所述的一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法，其特征在于所述的步骤（3）中DNA3的终浓度为15nM。

5.根据权利要求1所述的一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法，其特征在于所述的步骤（3）中石墨烯氧化物和DNA3的孵育时间为40min。

6.根据权利要求1所述的一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法，其特征在于所述的步骤（3）中MMP-9和双链DNA反应物的孵育时间为1h。

7.根据权利要求1所述的一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法，其特征在于所述的步骤（3）中反应终体系的孵育反应时间为30min。