[发明专利]提高梅花成熟胚子叶不定芽诱导率的胚处理方法及专用培养基

说明书

本发明属于植物组织培养领域，涉及提高梅花成熟胚子叶不定芽诱导率的胚处理方法及专用培养基。步骤包括：a)将消毒后梅花成熟胚切去远胚轴端子叶，保留近胚轴端子叶；b)用解剖刀剥去种皮，刀尖沿两片子叶间的缝隙插入，将两片子叶分开；c)用解剖刀刀尖将子叶内侧顶端的胚根、胚轴和胚芽轻轻挑除，确保全部挑除干净，尽量保留近胚轴端的子叶；d)将挑除胚根、胚轴、胚芽后成熟胚的每片子叶沿中线一分为二切开，得到四个近胚轴端成熟胚子叶外植体；e)将近胚轴端成熟胚子叶接种到再生培养基中，诱导不定芽，使不定芽伸长、生根培养得到再生植株。本发明还公开了专用培养基。本发明成熟胚子叶不定芽诱导率达42.64％～50％。

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，与园林植物组织再生有关，具体涉及提高梅花成熟胚子叶不定芽诱导率的胚处理方法及专用培养基。本发明是梅花成熟胚子叶再生培养时所使用的一种新型的胚处理方式，通过这种新型的胚处理方式处理的梅花成熟胚子叶不定芽诱导率，显著高于原有胚处理方式所处理的梅花成熟胚子叶。本发明还涉及专用培养基。

背景技术

梅花(Prunus mume Sieb.et Zucc.)属蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)植物，小乔木，花期冬春季。在中国园林及花文化中，梅花有着举足轻重的地位和影响(陈俊愉1989)。在园林建设之中，以梅花为材料的造景形式多样，不仅可以孤植、丛植、群植、林植或与水体、山体、园林建筑等相结合，还可作为插花、盆栽、盆景用来把玩欣赏，各有韵味(梁英梅2011)，在我国的园林建设中具有广阔的应用前景。

为了加速抗寒梅花的育种，梅花的再生和遗传转化体系研究已开展多年，但较为成熟的技术体系鲜见报道。这主要碍于梅花自身的顽拗性较强，高效的再生体系建立较为困难，以此为基础的遗传转化体系进展缓慢。梅花再生的途径主要有体胚再生和不定芽再生，可用于不定芽再生的外植体包括叶片(朱丹红2013)、胚轴(闻娟2009；石妍2015)、子叶(刘青林1999；宁国贵2010；闻娟2009；石文芳2012；曹珊珊2015；杨佩娟2016)等，其中以梅花成熟胚子叶为外植体的再生体系研究较为深入，相对稳定。目前，梅花成熟胚再生体系所采用的实验材料为“花后110d”，方法是，选取完全成熟且自然脱落、无病虫害的梅果，在一周内去除果肉，保留果核，阳光下晒干后保存于常温干燥处。进行再生实验前先对种子消毒，将去除内果皮的完整种胚置于盛有清水的广口瓶中，加洗衣粉浸泡20min，之后瓶口覆纱布流水冲洗20min，在超净工作台中用75％酒精摇洗30s，0.1％HgCl₂浸泡15min，再用无菌水摇洗4-5次(每次1min)，之后置于装有无菌水的灭菌三角瓶中备用。之后在无菌超净工作台中，将消过毒的种子放置在无菌滤纸上，作如下胚处理：1)切去成熟胚远胚轴端子叶，保留近胚轴端子叶；2)剥去种皮，将种子子叶分成二片；3)在每片子叶顶端包含胚芽、胚轴和胚根的部分，用解剖刀做倒三角形切除，切角为60度左右，长度约3-4mm；4)将每片子叶沿中线纵切，分成二等份；5)将近胚轴端作切除处理后的子叶外植体置于再生培养基上，诱导不定芽的发生，之后对再生的不定芽进行伸长和生根培养。

按上述方式所处理的梅花成熟胚子叶能够将种子的胚根、胚轴、胚芽完全清除干净，不会在后期培养中出现胚芽萌发现象，但这种胚处理方式会将子叶近胚轴端分化程度低，再生能力高的一部分子叶也一并除去，大大减小了不定芽的诱导率。经过试验统计后，使用上述胚处理方式处理的梅花成熟胚子叶平均再生率一般在12.50％～30.15％左右，较低的再生率导致该再生体系的遗传转化体系的转化效率更低。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种提高梅花成胚子叶不定芽诱导率的胚处理方法及专用培养基,为建立高效的遗传转化体系打下基础。

本发明比较了不同的胚处理方式对梅花成熟胚子叶再生的影响，发现胚处理方式对梅花成熟胚子叶再生影响显著。本发明以挑除了胚芽、胚轴和胚根的梅花成熟胚的子叶为外植体替换原有的切除了含有胚芽、胚轴和胚根部分胚的子叶，特别是应用了切去远胚轴端子叶，保留近胚轴端子叶的胚处理即挑胚的方法，明显提高了梅花成熟胚子叶不定芽的诱导率。