[发明专利]基于光响应超分子开关构筑的智能谷胱甘肽硫转移酶

说明书

本发明公开了一种基于光响应超分子开关构筑的智能谷胱甘肽硫转移酶，其制备方法包括以下步骤：S1、判别谷胱甘肽硫转移酶的催化位点，将半胱氨酸取替，在谷胱甘肽的结合空腔外边缘定点突变引入半胱氨酸；S2、将环糊精和马来酰亚胺修饰的偶氮苯衍生物进行非共价复合，构建trans‑偶氮苯‑马来酰亚胺‑环糊精；S3、将trans‑偶氮苯‑马来酰亚胺‑环糊精上的马来酰亚胺基团共价修饰到半胱氨酸硫醇基团上，完成谷胱甘肽硫转移酶表面的特异性修饰。本发明提出的制备光控谷胱甘肽硫转移酶的方法，设计简单，催化和调控效果好，经5次活性开启和关闭循环后，其关闭效率仍能达到80.9％，且实用性广，对催化反应体系无污染。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及构筑环境响应型的智能酶体系。

背景技术

酶在控制生理条件下的生命活动过程中，也会受到反馈回路和各种触发诱导作用的严格控制。受到自然界对酶调节的启发，制备可开关的人造催化剂可以精确控制生物医学应用中的生化反应。例如偶氮苯，螺吡喃，二芳基衍生物等含刺激响应性官能团的有机催化剂已经被研发并投入使用。而且基于配体结合依赖的变构控制，许多配体也被用于调节超分子催化剂的催化活性。这些合成的催化剂表现出优异的可控性、适应性，并通过精确调整活性位点来改变反应物或产物的化学，区域以及立体选择性，虽然合成的催化剂可以通过变构来调控其活性，但其催化剂分子效率普遍偏低。还有一种实现酶学活性的光调控方法是利用化学合成的光抑制剂分子，通过其光响应构象变化竞争性抑制酶的底物结合，从而可逆控制酶分子活性，但这种方法的通用性较差，只能针对某一具体酶分子，设计其特有的抑制剂，因此适用范围窄。基于此，本发明提出一种基于光响应超分子开关构筑的智能谷胱甘肽硫转移酶。

发明内容

本发明的目的是为了解决智能酶现有制备技术中存在的缺点，而提出的一种针对天然酶开发的光响应性超分子开关，并成功运用该开关实现谷胱甘肽硫转移酶在紫外光/可见光照射下活性的反复调控。

基于光响应超分子开关构筑的智能谷胱甘肽硫转移酶，其制备方法包括以下步骤：

S1、对谷胱甘肽硫转移酶(GST)进行定点突变：判别GST的催化位点，将GST的所有半胱氨酸(Cys)用取代物进行取替，然后在GST的底物谷胱甘肽(GSH)的结合空腔外边缘定点突变引入Cys，用于GST的特异性修饰；

S2、制备trans-Azo-MAM-CD复合物：将环糊精(CD)和马来酰亚胺(MAM)修饰的偶氮苯(Azo)衍生物进行非共价复合，构建光响应超分子开关，同时使用一维核磁共振氢谱，ESI质谱和和紫外光谱对trans-Azo-MAM-CD复合物进行鉴定；

S3、GST的特异性修饰：通过Click反应将trans-Azo-MAM-CD复合物上的马来酰亚胺基团共价连接到S1步骤中定点突变引入GST的半胱氨酸硫醇基团上，完成光控谷胱甘肽硫转移酶的制备。

优选的，所述S1步骤中的催化位点位于GST底物GSH结合空腔的底部，且包含若干关键氨基酸残基，所述关键氨基酸残基为W7，W40，K44，N53，P55，Q66，S67和D100。

优选的，所述S1步骤中的取代物为丝氨酸或组氨酸中的任意一种。

优选的，所述S1步骤中的突变为L117C或K124C的任意一种或两种组合，且优选为L117C和K124C的组合。

优选的，所述S2步骤中CD的种类为α-CD或β-CD中的任意一种，且优选为α-CD。

优选的，所述GST若要进行开启操作，则对GST进行紫外光照射，trans-Azo-MAM进行异构化，并将CD从trans-Azo-MAM-CD复合物上解离，完成GST的开启操作；GST若要进行闭合操作，则对CD解离后的GST进行可见光照射，Azo-MAM进行顺反异构化，trans-Azo-MAM-CD复合物重新构建。