[发明专利]一种发酵乳杆菌优化培养基及其培养方法

权利要求书

1.一种发酵乳杆菌优化培养基的培养方法，其特征在于，发酵乳杆菌优化培养基的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)菌种划线培养：将发酵乳杆菌菌粉用无菌水稀释后，于MC培养基上分区划线，划线结束后，平皿倒置，35℃培养箱恒温培养40～72小时；

2)一级纯化培养：挑取平皿上溶钙圈较大的单菌落接种至装有MRS液体培养基的试管中，试管密封，35℃培养箱恒温静置培养15～20小时；

3)二级纯化培养：按3～5％接种量，将一级纯化培养好的菌悬液接种至装有MRS液体培养基的三角瓶中，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养15～20小时；

4)菌种保存：对二级纯化培养得到的菌悬液进行离心，12000rpm离心10分钟后得到菌泥，将菌泥溶解于混合液中，得菌泥混合液，将菌泥混合液分装在已灭菌的冻存管中，封口膜密封，冻存于-40～-80℃低温冰箱内，得发酵乳杆菌菌泥冻存管，备用；

5)冻存菌种复苏：取存于低温冰箱内的发酵乳杆菌菌泥冻存管，立即放入35℃水浴锅内进行菌种复苏，30～45s，至冻存管内液体全部融化；

6)菌种一级培养：将复苏好的1～2ml菌泥混合液直接接种至装有基础培养基的三角瓶A中，三角瓶A密封，35℃培养箱恒温静置培养16～24小时；

7)菌种二级培养：按照2～6％接种量，将一级培养结束的菌悬液接种至装有基础培养基的三角瓶B中，三角瓶B密封，35℃培养箱恒温静置培养16～24小时；

8)菌种三级培养：按照2～6％接种量，将二级培养结束的菌悬液接种至装有优化培养基的发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35℃恒温培养7～12小时；

9)菌种四级发酵：按照2～8％接种量，将三级培养结束的菌悬液接种至装有优化培养基的发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35℃恒温培养，在发酵开始3小时后，通过流加食品级NaOH溶液来维持恒定pH为4.80～5.30，培养周期6～12小时，直至监测到菌液OD₆₀₀值停止增长或呈负增长，立即停止发酵；

10)发酵液离心：四级发酵结束后，将发酵罐罐体温度调低，当罐内发酵液温度低于20℃时准备离心，离心设备采用管式离心机，离心前对转鼓进行蒸汽灭菌30min，离心转速为10000～15000rpm；

11)菌泥收集：离心结束后，收集转鼓内的菌泥；

所述的优化培养基包括如下组分，酵母蛋白胨20.0g/L、葡萄糖22.0g/L、蔗糖10.0g/L、乳糖22.0g/L、酵母浸出物10.0g/L、乙酸钠4.5g/L、硫酸镁0.06g/L、吐温80 0.65g/L、磷酸二氢钾2.2g/L、低聚异麦芽糖22.0g/L、柠檬酸2.5g/L、余量为无菌水；

所述优化培养基的制备方法：按照配方比例称量各组分，混合、加热溶解，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.30～6.80，115℃下灭菌30min，得发酵乳杆菌优化培养基。

2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤6)、7)中基础培养基的配制，按照配方比例为：酵母蛋白胨15.0～30.0g/L、葡萄糖25.0～35.0g/L、酵母浸出物3.0～6.0g/L、乙酸钠4.0～6.0g/L、硫酸镁0.1～0.3g/L、吐温80 0.5～0.75g/L、磷酸二氢钾1.5～3.0g/L、柠檬酸3.0～6.0g/L、余量为无菌水，称量各组分，混合、加热溶解，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.40～6.70，于115℃下灭菌30min。

3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤7)中基础培养基的体积占三角瓶B容积的40％～60％。

4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤8)、9)中优化培养基装液的体积占发酵罐容积的40％～60％。