[发明专利]检测中药材肉苁蓉的LAMP引物组合物、试剂盒、方法和用途

说明书

本发明所述的一种检测中药材肉苁蓉的LAMP引物组合物、试剂盒、方法和用途，所述LAMP引物组合物包括：正向内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；反向内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；正向外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；和反向外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示；上述LAMP引物组合物以中药材肉苁蓉的ITS2基因为靶基因进行扩增，保证了所筛选的基因序列具有高度的特异性，可以实现中药材肉苁蓉的高特异性和高灵敏度检测，保证了其能在短时间内进行大量的中药材肉苁蓉检测，且鉴定结果准确可靠。

技术领域

本发明属于中药材检测，具体涉及一种检测中药材肉苁蓉的LAMP引物组合物、试剂盒、方法和用途。

背景技术

肉苁蓉为《中国药典》2015年版一部收载的一种常用药材，为列当科植物肉苁蓉(Cistanche deserticola Y.C.Ma)或管花肉苁蓉(Cistanche tubulosa(Schenk)Wight)的干燥带鳞叶的肉质茎，具有补肾阳,益精血,润肠通便的功效，有“沙漠人参”之称，在治疗神经衰弱、老年尿频、妇女阴冷及便秘等方面有着独特的功效。

肉苁蓉及管花肉苁蓉均为沙漠多年生寄生植物,其独特的生物学特性及相对狭小的生活范围使得该资源自古就比较紧缺。随着中药事业的发展，肉苁蓉等药用植物的需求量逐渐增大，但是受利益驱动和资源紧缺的双重影响，次品、伪品冒充正品充斥着整个中药材市场，伪混品当道，而当药材使用不正确，极易对人身安全造成严重威胁，严重危害消费者的利益及正常的进出口贸易。因此，解决药材的真伪鉴别成为提高药材质量和保障进出口的重要课题。

中药材的传统鉴定方法包括基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定，虽然上述方法简便、直接，但是其主观性强，准确性常取决于鉴定者的经验，存在着效果不佳，准确性不够的劣势，特别是对于饮片或粉碎后的药材鉴定，传统鉴定方法存在相当大的困难。依赖经典形态分类以及传统鉴别方法已无法满足鉴别的需要。

近些年来，国内和国外已经开始运用生物化学和分子生物学等方法开始对中药材进行检测。如中国专利文献CN1896276A中公开的管花肉苁蓉鉴定引物序列及管花肉苁蓉的鉴别方法，其中设计了可以鉴别管花肉苁蓉的一对高特异性引物，该引物在给定的反应条件下，能够特异性鉴别管花肉苁蓉，对于其他伪品均不能扩增出相应的DNA片段，上述方案中应用了PCR技术鉴别管花肉苁蓉，可以快速方便的检测样品的真伪。但是由于PCR技术需要反复热变性，升降温过程比较复杂、耗时，所使用的PCR仪或测序仪以及凝胶电泳以及成像系统价格昂贵，进而使用PCR鉴别管花肉苁蓉成本比较高。近些年，在PCR基础上发展出了一种环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，是由日本荣研株式会社的Notomi等人于2000年开发出来的一种新型核酸扩增方法。它依赖于4条特异性引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速、高特异地扩增靶序列。这种链置换型的DNA聚合酶，使模板两端的引物结合处循环出现环状单链结构，保证引物顺利的与模板结合，进行链置换扩增反应。该技术更克服了需要反复热变性的PCR反应的特点，有效避免了升降温的过程当中耗时的缺点，实现了恒温条件下的连续快速扩增，可以在15-60min之内扩增109-1010倍靶序列拷贝。扩增产物检测快速简单，方法多样，主要有肉眼观察沉淀法、荧光染料检测法、琼脂糖凝胶电泳法和浊度仪检测法。LAMP具有扩增效率高，灵敏度强，特异性好的优点，而且不需要昂贵的PCR仪和试剂，只需要一个恒温加热装置即可，成本低，适用于在基层使用，在普通的实验室具有很好的应用前景，适用于中药材肉苁蓉的检测。然而在现有技术中还没有提出一种利用环介导等温扩增法鉴别肉苁蓉的方法。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于提出一种检测中药材肉苁蓉的LAMP引物组合物、试剂盒、方法和用途。