[发明专利]一种测定甘露糖醛酸类物质重均分子量和含量的方法

说明书

本发明属于天然药物化学和质量控制领域，涉及一种测定甘露糖醛酸类物质的可溶性盐重均分子量和含量的方法，包括使用甘露糖醛酸类物质的可溶性盐样品中的金属离子含量对SEC‑MALS测定酸性糖的重均分子量和含量结果进行校正。利用本发明方法可快速、准确测定甘露糖醛酸类物质的可溶性盐w的重均分子量、含量。

技术领域

本发明属于天然药物化学和质量控制领域，涉及一种测定甘露糖醛酸类物质、特别是其可溶性盐的重均分子量和含量的方法。

背景技术

甘露糖醛酸类物质主要来源于海藻酸钠。海藻酸钠经酸解分级后，得到聚甘露糖醛酸(分子量约在2k-10kDa)，聚甘露寡糖醛酸经氧化得到甘露寡糖二酸(分子量在400-3000Da之间)。甘露寡糖二酸是具有特定分子骨架的低分子海洋酸性寡糖类化合物，可用于抗阿尔兹海默病(AD)。临床前药效学等研究结果表明甘露寡糖二酸具有对神经细胞的保护作用，最终改善记忆功能障碍，从而有效治疗阿尔兹海默病。通常以其可溶性盐的形式用于制备药物。中国专利申请CN1933845A及国际专利申请PCT/CN2016/113879公开了聚甘露糖醛酸及甘露寡糖二酸的相关情况。

中间体聚甘露糖醛酸及终产物甘露寡糖二酸的可溶性盐的重均分子量和含量是研制甘露寡糖二酸药物的重要测定参数。目前，中国药典中，高效液相凝胶渗透色谱法(GelPermeation Chromatography,GPC)是测定分子量的常规做法，其是按照排阻色谱的原理，不同分子量的多糖按照其大小顺序先后流出色谱柱，通过一系列不同分子量标准多糖与保留时间的相关性测得的校正曲线并计算相应的待测多糖的相对分子量。但该常规方法必须要有相应的多糖标准品而有一定的局限性。

此外，多糖和寡糖含量的测定常用方法为硫酸咔唑法，该方法首先以浓度及单糖标准品的显色做标准曲线，再在标准曲线上读出待测样品的含量。但是酸性糖的单糖甘露糖醛酸并没有标准品出售，若以葡萄糖醛酸为标准品，其与酸性糖的结构及显色效率存在差异，不能对酸性糖进行精确定量。

近年来出现的尺寸排阻色谱联用多角度激光散射(Size-ExclusionChromatography/Multi-Angle Laser Light Scattering，SEC-MALS)测定样品绝对重均分子量、分子量分布和含量在业界引起了广泛的关注。18角度激光光散射仪(MALS)工作原理是：激光束通过溶液会产生光散射，散射光强度与样品分子量及溶液浓度成正比，不同散射角度的光强及分子尺寸有关，因此在样品池周围不同位置设立多个检测探头(分子量的测量精度与角度数目的平方根成正比)同时接收不同角度的散射光强度信号。依照光散射方程K*c/R(θ)＝1/M_WP(θ)+2A₂c作Zimm图，即可得到大分子的重均绝对分子量Mw，均方旋转半径rg及第二维利系数A₂。MALS和尺寸排阻色谱(SEC)联用，不必依赖泵的流速、校正曲线及其他错误的假设，即可直接求的分子量及分子量分布等数据。MALS利用色谱柱分离出的样品在不同角度的光散射量，由示差折光(RI)检测器得到洗脱液浓度及dn/dc值计算得到质量，综合两者即可计算出各个切片的分子量。该方法不需标准品校准，克服了样品与标准品的化学组成、分子结构及大小不同带来的相对分子量测定的误差。已有研究者采用这一方法测定了壳聚糖、透明质酸的平均分子量(Monica Fee,Neil Errington,Kornelia Jumel,et al.Correlation of SEC/MALLS with ultracentrifμge andviscometric data for chitosans.Eur Biophys J(2003)32:457～464；Sanya Hokputsa,Kornelia Jumel,Catherine Alexander,et al.Comparison of molecular massdetermination of Hyaluronic acid using SEC/MALLS and sedimentationequilibrium.Eur Biophys J(2003)32:450～456)，还有研究者采用该方法对天然中性多糖进行定量，并预测该方法将成为多糖定量的一种常规技术(Kit-Leong Cheong,Ding taoWu,Jing Zhao,et al.A rapid and accurate method for the quantitativeestimation of natural polysaccharides and their fractions using highperformance size exclusion chromatography coupled with multi-angle laserlight scattering and refractive index detector.Journal of Chromatography A(2015)1400:98～106)。目前欧洲药典已经采用此方法作为羟乙基淀粉重均分子量及分子量分布的测定方法(European pharmacopoeia 8.0,p3307-3308,starcheshydroxyethyl)。