[发明专利]杂交瘤细胞株4A5及灿烂弧菌鞭毛蛋白FlgT单克隆抗体

说明书

技术领域

本发明涉及一种杂交瘤细胞株及单克隆抗体，尤其是一种杂交瘤细胞株4A5及灿烂弧菌鞭毛蛋白FlgT 单克隆抗体。

背景技术

灿烂弧菌隶属于属弧菌科（Vibrionaceae），是刺参（Apostichopus japonicus）养殖中极为常见的刺参化皮病（腐皮综合征）的主要致病菌。该病传染性强、传播范围广，能引起刺参发生大面积的体表溃疡、口肿溃烂、身体萎缩、排脏等症状。此外，灿烂弧菌也能导致多种鱼类、双壳贝类、甲壳类和棘皮动物发病甚至死亡，使被感染的鱼体两侧，特别是靠近尾部处出现出血点，导致皮肤腐烂，形成溃疡，背鳍、胸鳍、尾鳍的鳍条基部充血，肾脏、肝脏糜烂等症状。因此，检测灿烂弧菌意义重大。目前，针对细菌的检测方法主要有传统的微生物学检测技术（平板培养法）、分子生物学方法及免疫学检测方法。平板培养法是操作相对简单，但过程复杂，耗时较长；分子生物学检测方法灵敏度高、特异性强，但需要特殊的仪器设备和专业人员，达不到快速、现场检测的目的，不适合在基层推广使用。免疫学检测方法具有操作相对简单、灵敏度高、检测时间短、处理样品多等特点，但是需要具有特异性强的抗体或抗原。现有灿烂弧菌单抗（单克隆抗体）是采用灿烂弧菌全菌制备的杂交瘤细胞株所分泌，特异性较差，难以应用于免疫学检测。

FlgT是组成灿烂弧菌鞭毛蛋白中H环所不可缺少的结构蛋白，全长254个氨基酸，分子量大小约为30 KDa。FlgT对维持正常的鞭毛功能有着重要的作用，当缺少FlgT 时，定子的正确装配以及鞭毛的运动功能都会受到影响。但是，迄今为止，并没有以FlgT蛋白制备分泌灿烂弧菌鞭毛蛋白FlgT 单克隆抗体的杂交瘤细胞株的相关报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种杂交瘤细胞株4A5及灿烂弧菌鞭毛蛋白FlgT 单克隆抗体。

本发明的技术解决方案是：一种杂交瘤细胞株4A5，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No. 14311。

一种灿烂弧菌鞭毛蛋白FlgT 单克隆抗体，是杂交瘤细胞株4A5分泌的。

本发明是利用重组蛋白FlgT作为抗原免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0 细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA 法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗灿烂弧菌鞭毛蛋白FlgT单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为4A5，所分泌的抗灿烂弧菌鞭毛蛋白FlgT单克隆抗体更具有特异性，可应用于灿烂弧菌的免疫检测。

分泌灿烂弧菌鞭毛蛋白FlgT 单克隆抗体的杂交瘤细胞株4A5杂保藏日期：2017年7月5日；

分类命名：抗灿烂弧菌鞭毛蛋白FlgT 单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏号：CGMCC No. 14311。

具体实施方式

本发明的杂交瘤细胞株4A5，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No. 14311。杂交瘤细胞株4A5分泌灿烂弧菌鞭毛蛋白FlgT单克隆抗体。

杂交瘤细胞株4A5制备方法如下：

1. 制备免疫抗原

（1）重组表达载体的构建：根据FlgT 核苷酸序列（FlgT 核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，762 bp) 设计引物进行PCR 扩增，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI 和MluI ，插入表达载体pET-22b T7启动子下游，构建FlgT 重组表达质粒；

（2）FlgT 重组蛋白的表达与纯化：以 E. coli BL21菌株为表达菌株，将FlgT重组表达质粒转入表达菌株中进行FlgT 重组表达。裂解离心取沉淀，经过包涵体复性及纯化，获得纯化的FlgT 重组蛋白，即免疫抗原。

2. 制备杂交瘤细胞株：采用免疫抗原免疫BALB/c 小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0 细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA 法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗灿烂弧菌鞭毛蛋白FlgT 单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为4A5。

具体方法如下：

1. 制备免疫抗原

1.1 灿烂弧菌鞭毛蛋白FlgT 的表达

原核表达载体pET-22b T7 的构建：

以灿烂弧菌JZ6 基因组为模板，设计引物并通过PCR 扩增后，得到FlgT 基因；具体过程如下：