[发明专利]使用CRISPR技术敲除miR-3187-3p在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的应用

说明书

本发明提供一种利用CRISPR‑Cas9特异敲除miR‑3187‑3p基因的方法，所述方法为：（1)构建Cas9表达载体；(2构建sgRNA表达载体;(3)将Cas9、sgRNA‑混合成混合液，注射哺乳类动物受精卵，实现将miR‑3187‑3p基因定点敲除的目的。

技术领域

本发明涉及CRISPR技术在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的应用，属于医药生物技术领域。

背景技术

冠状动脉粥样硬化性心脏病是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病，常常被称为“冠心病”。但是冠心病的范围可能更广泛，还包括炎症、栓塞等导致管腔狭窄或闭塞。世界卫生组织将冠心病分为5大类：无症状心肌缺血(隐匿性冠心病)、心绞痛、心肌梗死、缺血性心力衰竭(缺血性心脏病)和猝死5种临床类型。临床中常常分为稳定性冠心病和急性冠状动脉综合征。

在临床表现上主要体现在典型胸痛。因体力活动、情绪激动等诱发，突感心前区疼痛，多为发作性绞痛或压榨痛，也可为憋闷感。疼痛从胸骨后或心前区开始，向上放射至左肩、臂，甚至小指和无名指，休息或含服硝酸甘油可缓解。胸痛放散的部位也可涉及颈部、下颌、牙齿、腹部等。胸痛也可出现在安静状态下或夜间，由冠脉痉挛所致，也称变异型心绞痛。如胸痛性质发生变化，如新近出现的进行性胸痛，痛阈逐步下降，以至稍事体力活动或情绪激动甚至休息或熟睡时亦可发作。疼痛逐渐加剧、变频，持续时间延长，祛除诱因或含服硝酸甘油不能缓解，此时往往怀疑不稳定心绞痛。

目前，治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病主要使用抗心绞痛药物，比如硝酸酯类，肾上腺素β受体阻断药，钙通道阻滞剂等。CN105816722A中公开了一种治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的中药制剂，其原料药包括川芎、桃仁、红花、赤芍、当归、土鳖虫、九香虫、川牛膝、红曲、生山楂、雄黑豆、穿山甲、延胡索、醋香附、银杏叶、降香、茯神、远志、乌枣、甘松、琥珀、五爪龙、柴胡、葛根、桔梗、乌贼鱼墨囊。该中药制剂针对病因病机组方用药，具有辨证论治的优势，克服了传统西药无法区分证型进行对证治疗，通过中药的内服，可以在一定程度上替代西药的使用，降低药物依赖性及副作用等。CN 101332246 B中公开了治疗冠心病和心绞痛的中药制剂，主要包括丹参18-22、三七4-6、赤芍17-23、降香13-18、元胡13-18、红花7-11、何首乌18-22、鸡血藤25-35、没药18-22、人参13-17、肉桂13-17、淫羊藿18-22、鹿茸4-6、灵芝11-15、冬虫夏草7-9、川芎12-18、桃仁8-12、乳香13-17、全蝎4-6、蜈蚣4-6、丹皮12-17等组分，根据实验结果来看具有一定的效果。

在现有技术中，CN 103877576 B中公开了以Card3基因敲除小鼠和心脏特异性Card3转基因小鼠为对象，通过阻断小鼠心脏左冠状动脉前降支造成心肌梗死模型进行研究，结果表明与WT小鼠对比，Card3基因敲除小鼠心脏梗死比例、心肌肥厚和纤维化的程度明显被抑制，心功能明显好转；CN 103893743 B中以GDF1基因敲除小鼠和心脏特异性GDF1转基因小鼠为实验对象，通过阻断小鼠心脏左冠状动脉前降支造成心肌梗死模型进行研究，结果表明与MEM-Cre对照小鼠对比，GDF1基因敲除小鼠心脏梗死比例、心肌肥厚和纤维化的程度明显增加，心功能明显恶化；而心脏特异性GDF1转基因小鼠的心脏梗死比例、心肌肥厚和纤维化的程度明显被抑制，心功能明显改善。CN 103898189 B中公开了以SHPS-1基因敲除小鼠和心脏特异性SHPS-1转基因小鼠为实验对象，通过阻断小鼠心脏左冠状动脉前降支(LAD)造成心肌梗死模型，结果表明与WT对照小鼠对比，SHPS-1基因敲除小鼠在MI术后心脏梗死比例、心肌肥厚和纤维化的程度明显被抑制，心功能明显好转；CN 103893763 B中公开了以Vinexin-β基因敲除小鼠和心脏特异性Vinexin-β转基因小鼠为实验对象，通过阻断小鼠心脏左冠状动脉前降支(LAD)造成心肌梗死模型，结果表明与WT对照小鼠对比，Vinexin-β基因敲除小鼠在MI术后心脏梗死比例、心肌肥厚和纤维化的程度明显被抑制，心功能明显好转。通过以上结果可以发现，通过基因干扰可以实现冠状动脉粥样硬化性心脏病的治疗。