[发明专利]一种口蹄疫抗原的定量方法

说明书

本发明提供了一种口蹄疫抗原的定量方法，所述方法包括以下步骤：A、配置不同浓度的口蹄疫抗原标准样品，采用HPLC对标准样品进行测定，获得标准抗原浓度和抗原吸收峰面积的关联公式；B、将待测样品进行预处理，然后采用HPLC测定其抗原吸收峰面积，根据步骤A的关联公式计算待测样品的抗原浓度。本发明解决了HPLC无法在口蹄疫病毒定量中的无法广泛使用的困境，使得HPLC使用范围更加广泛和准确。且本发明采用添加杂蛋白的预处理，可大大缩短样品的处理时间，提高检测的准确性。

技术领域

本发明涉及口蹄疫抗原的定量分析技术领域，具体涉及一种口蹄疫抗原的定量方法。

背景技术

口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疫病，侵染对象是猪、牛、羊等主要畜种及其它家养和野生偶蹄动物，易感动物多达70余种。目前，疫苗免疫是口蹄疫诸多防制措施中最重要也是最成功的措施之一，其中常规灭活疫苗是当前口蹄疫免疫防控的最主要疫苗。

口蹄疫定量分析方法目前以蔗糖梯度密度为主，检测程序复杂，不适合快速检测。而开发利用高效液相层系统(HPLC)进行定量已成为口蹄疫抗原定量的趋势。专利CN104634891A中公开了一种快速、准确、重复性好的口蹄疫疫苗抗原146S测定方法，选取了分子量分离范围为2×10⁴-1×10⁷Da的色谱柱，在高效液相色谱仪上对被检测的样品进行色谱分离，用于口蹄疫抗原含量的鉴定。然而，该方法在实际操作时，和普遍的HPLC方法一样，当待测定样品的溶液体系(包括缓冲溶液组分、电导、pH范围)不同时，其测得的样品浓度出现明显浮动。即待测样品的溶液体系尤其是电导可明显影响HPLC的定量结果。发明人在前期进行了如下试验：分别采用浓度为5μg/mL的标准口蹄疫疫苗抗原146S样品制备成不同氯化钠浓度(电导分别为：54.6mS/cm和5mS/cm)的标准样品，采用专利CN104634891A中的方法进行定量分析，结果分别为7.9μg/ml和4.8μg/mL。其结果偏差可达33％,不能用于不同溶液条件下口蹄疫抗原含量的准确测定。在口蹄疫抗原的制备过程溶液电导会随加工流程发生变化，以及产品批次的电导也会发生偏差，由此导致在实际操作中，仍存在结果的准确性不高的问题。

且发明人前期利用三根全新的TSK-G4000SW_XL色谱柱对破乳疫苗进行反复检测中，其使用寿命分别为312次，241次，449次，色谱柱使用寿命短主要是葡聚糖凝胶的耐压性差，易被破乳样品中残留的佐剂污染，难以清洗造成。

此外，在抗原样品的预处理过程中，通常采用常规的PEG沉淀法对病毒样品沉淀，但由于待测样品病毒浓度过低(通常不大于20μg/mL)，无法在较短时间内获得沉淀，通常需静置过夜才能进行后续的步骤，无法达到高效、快速、准确的要求，而常规的超滤浓缩后再PEG沉淀的方式又会造成病毒在膜上的吸附，形成的损失无法确定，影响测定结果的可靠性。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种高效、快速的口蹄疫抗原的定量方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种口蹄疫抗原的定量方法，所述方法包括以下步骤：

A、配置不同浓度的口蹄疫抗原标准样品，采用HPLC对标准样品进行测定，获得抗原浓度和抗原吸收峰面积的关联公式；

B、将待测病毒溶液进行预处理，然后采用HPLC测定其抗原吸收峰面积，根据步骤A的关联公式计算待测样品的抗原浓度。

优选地，步骤A中，所述关联公式为：

C＝a×PA+b

其中C为抗原浓度，单位为μg/ml；PA为吸收峰面积，单位为mAU×s；所述a和b为常数，分别为a＝0.0542，b＝0.494。