[发明专利]一种快速高效获得木薯体细胞胚的方法

权利要求书

1.一种快速高效获得木薯体细胞胚的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）设计一种木薯非胚性愈伤组织的洗脱装置，包括扁匙、过滤杯、支架和废液接收罐，所述过滤杯的底部设有不锈钢过滤网；所述支架包括上下两个圆环，两个圆环一侧通过竖直杆连接，支架上部的圆环与过滤杯相连，下部的圆环与废液接收罐相连；

（2）将木薯的绿色子叶加无菌水浸没后切碎，均匀涂抹在体胚诱导培养基上，置于25～27℃、黑暗环境下诱导培养10～15天后，获得大量脱分化的愈伤组织及少量体细胞胚，所述的愈伤组织包含水渍化的具有粘性的非胚性愈伤组织，以及玻璃化的脆性的胚性愈伤组织；

（3）将步骤（2）得到的脱分化的愈伤组织及少量体细胞胚转移至步骤（1）设计的洗脱装置中的过滤杯，过滤杯底部过滤网的网眼适合所述的非胚性愈伤组织通过，而所述的体细胞胚和胚性愈伤组织不能通过；倒入洗脱液，用扁匙缓慢搅拌，促使非胚性愈伤组织与胚性愈伤组织及体细胞胚脱离并被冲洗至废液接收罐中，待洗脱液都流至废液接收罐后，再次倒入洗脱液至过滤杯中，重复冲洗3～5次；所述的洗脱液的组成为：250～300mmol/L甘露醇、13-16mmol/L CaCl₂；

（4）将洗脱后留在过滤杯中的材料转移至放有滤纸的无菌培养皿中，在体视显微镜下镜检，进一步剥离非胚性愈伤组织，将剥离后的胚性愈伤组织及体细胞胚转移至滤纸上，吸干水分后，转移至体胚诱导培养基上，置于25～27℃、黑暗环境下诱导培养10～15天；

（5）将步骤（4）的培养物按照步骤（3）进行二次洗脱，将二次洗脱后的材料转移至体胚诱导培养基上，置于25～27℃、黑暗环境下继续诱导培养10～15天，获得大量肉眼可见的体细胞胚；

步骤（2）、（4）和（5）中所述的体胚诱导培养基的组成为：MS+毒莠定10～15µg/L、CuSO₄1.5～2.1µmol/L。

2.根据权利要求1所述快速高效获得木薯体细胞胚的方法，其特征在于，步骤（1）中所述两个圆环和竖直杆是由一根不锈钢丝弯折扭转而成的一体结构。

3.根据权利要求1所述快速高效获得木薯体细胞胚的方法，其特征在于，步骤（1）中所述支架上部的圆环与过滤杯可拆卸连接，下部的圆环与废液接收罐可拆卸连接。

4.根据权利要求1所述快速高效获得木薯体细胞胚的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的过滤杯侧面设有把手。

5.根据权利要求1所述快速高效获得木薯体细胞胚的方法，其特征在于，步骤（1）中所述废液接收罐的瓶口设有橡胶圈，能与支架下部的圆环稳固连接。

6.根据权利要求1-5任一项所述快速高效获得木薯体细胞胚的方法，其特征在于，该方法的整个操作过程中均处于无菌环境。

7.根据权利要求1-5任一项所述快速高效获得木薯体细胞胚的方法，其特征在于，所述的木薯品种为华南8号木薯。