[发明专利]一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法

权利要求书

1.一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法，其特征在于所述方法为：

(1)将质粒pCas9转入大肠杆菌BL21，获得大肠杆菌BL21 pCas9；

(2)根据靶标基因设计1对反向互补的引物，所述引物中的一条含靶标基因20个核苷酸序列，以pTargetF质粒为模板，PCR扩增，获得的PCR产物转化大肠杆菌感受态细胞，筛选获得含靶标基因20个核苷酸序列的pTargetF质粒，即为辅助质粒pTargetF；

(3)构建携带选择性标记和待敲除基因上下游同源序列的DNA片段；

(4)将步骤(2)获得的辅助质粒pTargetF和步骤(3)获得的DNA片段通过化学转化的方法转入大肠杆菌BL21 pCas9感受态细胞，获得敲除靶标基因的大肠杆菌。

2.如权利要求1所述由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法，其特征在于步骤(4)中辅助质粒pTargetF和DNA片段质量比为1:1～1:10。

3.如权利要求1所述由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法，其特征在于步骤(4)转入方法为：将辅助质粒pTargetF和DNA片段与大肠杆菌BL21 pCas9感受态细胞混合，冰浴30min，然后42℃热激90s之后迅速置冰上1～2min，加入30℃预热的LB培养基中，混匀后30℃，200r/min培养1h，离心弃上清大部分，剩余上清跟沉淀混匀，取混合液涂布于选择性LB琼脂培养基上，30℃培养12～24h，挑取转化子，划线到选择性LB琼脂培养基上复筛，获得敲除靶标基因的大肠杆菌。

4.如权利要求1所述基于由化学转化介导的CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法，其特征在于靶标基因为panD基因，所述方法为：(1)将质粒pCas9转入大肠杆菌BL21，获得大肠杆菌BL21 pCas9；

(2)根据靶标基因设计1对反向互补的引物pTargetF-panD1和pTargetF-panD2，所述引物pTargetF-panD1含靶标基因20个核苷酸序列，以pTargetF质粒为模板，PCR扩增，获得的PCR产物转化大肠杆菌感受态细胞，筛选获得含靶标基因20个核苷酸序列的辅助质粒pTargetF；

pTargetF-panD1:GTCCTAGGTATAATACTAGTGATATCTGGAATGTCACCAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；

pTargetF-panD2:ACTAGTATTATACCTAGGACTGAG；

(3)以敲除目标基因的大肠杆菌为模板，根据待敲除靶标基因位点上下游核苷酸序列设计引物F和R，菌落PCR扩增筛选含选择性标记基因和拟敲除靶标基因上下游同源DNA序列的DNA片段；

F：5’-AGATAACCGGGATTGCCCT-3’；

R：5’-TGAGCCGCTATGCGTATCC-3’；

(4)将步骤(2)获得的辅助质粒pTargetF和步骤(3)获得的DNA片段以质量比1:4与大肠杆菌BL21 pCas9感受态细胞混合，冰浴30min，然后42℃热激90s之后迅速置冰上1～2min，加入30℃预热的LB培养基中，混匀后30℃，200r/min培养1h，离心弃上清大部分，剩余上清跟沉淀混匀，取混合液涂布于含有25μg/mL氯霉素的LB琼脂培养基上，30℃过夜培养12～24h，挑取转化子，划线到含25μg/mL氯霉素的LB琼脂培养基上复筛，获得敲除靶标基因的大肠杆菌。