[发明专利]一种表达重组人NLK基因的质粒及构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术及基因工程领域，具体涉及一种蛋白激酶Nemo样激酶基因NLK及其重组质粒的构建方法。

背景技术

Nemo样激酶(Nemo-like kinase,NLK)是一进化保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，于1998年被克隆，与黑腹果蝇的nmo属同源物，其编码基因定位于17q11.2，编码大小约58.3KD的丝氨酸/苏氨酸激酶。最初的研究认为NLK与爪蟾、果蝇、线虫等模式生物的发育相关，在人体的研究发现，NLK参与神经生长因子(NGF)诱导的神经外生性生长；NLK通过抑制Wnt通路抑制造骨新生；同时也参与依托泊苷诱导的精细胞凋亡，以上研究证实NLK在生物体内参与多项生命活动。

在肿瘤中的研究发现，NLK参与多条细胞内信号传导通路，NLK的表达异常与肿瘤的发生、发展、预后密切相关。在结肠癌中的研究发现，NLK参与Wnt通路的调控，Wnt信号通路是一条进化保守的信号传导通路，大量研究显示Wnt不仅在胚胎发育中起重要作用，而且与多种肿瘤的发生发展密切相关。目前认为经典Wnt通路的组成包括：细胞外因子、跨膜受体、胞质蛋白及核内转录因子等一系列蛋白，Wnt与frizzled结合后促使β-catenin由细胞质向细胞核移位，并在细胞核中与转录因子TCF/LEF共同作用激活c-myc、Cyclin D1、MDR1、PPAR-δ等靶基因的转录。MAP3K家族中的TAK1被认为是NLK的上游活化蛋白，非经典Wnt5a-Ca2+信号可以作为TAK1/NLK上游的活化信号，活化的NLK通过磷酸化TCF而抑制β-catenin/TCF复合物的转录活性从而抑制经典的Wnt/β-catenin信号，使细胞周期停滞在G1期。在进一步的研究中发现，NLK能够通过磷酸化转录共激活因子CBP/P300的C-末端区域而影响NF-kB、AP-1、Smad等转录因子活性发挥生物学功能。

在前列腺癌的研究中发现，雄激素受体(Androgen Receptor,AR)表达阳性的人前列腺癌细胞中诱导NLK的表达可以促使细胞凋亡。在进一步的研究中发现，NLK不仅能够与AR形成复合物抑制AR对靶基因的转录活性，而且在转录水平抑制AR mRNA的表达；在乳腺癌中，NLK促进c-Myb降解，抑制肿瘤细胞增殖，并诱导凋亡。然而另一项研究却发现，在人肝癌细胞系中敲低NLK的表达能够抑制肿瘤细胞的生长，同时实验结果显示，敲除NLK后细胞周期相关蛋白CyclinD1、CDK2的表达也明显降低，细胞周期发生G1/S阻滞。与之相同的是，在人口腔腺癌细胞CAL27中敲低NLK能够显著抑制肿瘤细胞增殖；在胆囊癌中，NLK敲低后细胞增殖和转移能力明显降低。尤其值得关注的是，NLK低表达的卵巢癌患者的生存期较短，且在卵巢癌中提高NLK的表达可增加肿瘤细胞对顺铂的敏感性，但是在喉癌的研究中却发现NLK敲低后喉癌细胞Hep-2对紫杉醇的敏感性增加，且细胞增殖能力降低。我们前期研究也发现，NLK可能作为二甲双胍的潜在靶基因，二甲双胍处理或敲减NLK均能抑制肺癌细胞增殖及干性表型等。由此可见，NLK在不同组织来源的肿瘤中发挥不同的生物学功能。

越来越多的研究表明，NLK在肿瘤等疾病中发挥重要作用，可能是肿瘤治疗的潜在靶标，使NLK成为目前研究热点之一，而对于NLK基因功能及其机制的研究，迫切需要利用基因工程构建其过表达质粒。

发明内容

本发明的目的在于针对NLK基因在肿瘤中的研究现状及其可作为潜在治疗靶点的应用前景，提供一种表达重组人NLK基因的质粒及构建方法。

一种表达重组人NLK基因的质粒的构建方法，其包括如下步骤：

S1,设计能特异性克隆人NLK基因的引物并在其上游添加限制性内切酶识别序列及保护性碱基，化学合成该引物；

S2，用PCR反应合成该含有限制性内切酶识别序列及保护性碱基的人NLK基因序列；

S3，将含有限制性内切酶识别序列的人NLK基因序列与pcDNA3.0载体分别进行双酶切反应；

S4,用T4DNA连接酶将双酶切后的人NLK基因序列与双酶切后的pcDNA3.0载体进行连接，形成重组质粒；

S5，将重组质粒进行感受态细胞转化、培养、筛选和测序验证，挑选出正确克隆的重组菌液；

S6，提取正确克隆的重组菌液中的质粒；

S7,用Western blot验证上一步中重组质粒于细胞内NLK蛋白的表达情况。

优选的，所述的步骤S1中包含如下步骤：