[发明专利]利用环介导等温扩增技术检测食源性肺炎克雷伯菌的方法及引物

说明书

本发明公开了一种利用环介导等温扩增技术检测食源性肺炎克雷伯菌的方法及引物。所述方法包括：提取待检测样品的DNA；以所述的DNA为模板，利用所述的引物进行LAMP反应；对反应产物进行鉴定，判断待检测样品中是否含有肺炎克雷伯菌。发明针对肺炎克雷伯杆菌khe毒力基因的保守序列设计引物，并进一对LAMP反应体系进行优化，可稳定、高特异性、高灵敏度的检测肺炎克雷伯杆菌。

技术领域

本发明涉及食源性致病微生物的检测，尤其涉及一种利用环介导等温扩增技术检测食源性肺炎克雷伯菌的方法。

背景技术

目前对于细菌的检测方法主要有细菌分离培养鉴定方法、免疫学检测方法、病理组织切片方法和分子生物学方法。

细菌分离培养鉴定是应用液体培养基、半固体培养基或固体培养基将分离得到的疑似细菌进行培养，并应用溶血实验、运动性实验、产酸产气等生化实验及染色镜检对微生物进行诊断。目前，在我国境内最常见也是应用最广泛的是国标法(GB4789.30-94)，还有其他的分离鉴定方法如FDA(美国食品药品监督管理局)法、改良FDA法、行标法(SN)和GNFIS法等。这类方法在目前所有类型的检测方法中的准确性是最高的，但是无论是哪种分离培养技术，他们都有一个共同的缺点，就是从样品的采集到病原微生物的分离鉴定结果，需要的试验周期都会很长，一般微生物的培养需要2天左右，有些微生物的分离培养需要十多天，才能得出结果，不能够适应目前快速、准确诊断的需求市场。同时由于操作的过程中，接触活体的细菌，对实验室操作人员构成一定的健康威胁。

免疫学检测方法的原理是根据抗原-抗体结合形成沉淀的复合物，其中包括凝集反应方法、沉淀反应方法、免疫荧光技术、放射免疫测定方法、酶联免疫吸附试验、补体结合试验等。免疫学检测方法是基于抗原与抗体特异性结合的原理进行检测的一种血清学方法。这种诊断方法的缺点是检测过程中，需要的试剂非常昂贵，同时此方法在检测过程中，根据不同的检测目标微生物，其特异性也不尽相同，容易出现假阳性结果，造成误判，同时人为的操作对于实验结果的影响也是有的，所以需要具有一定素质和能力的实验室专业人员。

病理组织切片方法是取一定大小的病变组织，用病理组织学方法制成病理切片〔通常将病变组织包埋在石蜡块里，用切片机切成薄片，再用苏木精－伊红(H-E)染色〕，用显微镜进一步检查病变。根据病变的发生发展过程，最后作出病理诊断。这种检测方法虽然准确性很高，但是最大的问题是，对从事病理组织学诊断的人员的专业性的要求会非常高，需要专业的病理组织学教师或者从事病理组织学研究的研究生，才有可能进行准确的诊断，也可以说这类诊断方法需要在显微病理学知识上具有丰富经历和经验的实验人员。

分子生物学是在分子水平上研究生命现象物质基础的学科。常见的应用于检测微生物方法有核酸(DNA)的凝胶电泳实验、核酸的分子杂交实验、核酸的体外扩增实验等方法，这些方法的优点是检测方法的特异性非常高，检测时间可以在6小时内完成。本方法的缺点在于，需要昂贵的变温反应装置和检测仪器。分子生物学诊断方法在实验过程中需要复杂的变温仪器，这种仪器的价格很高，对于基层的投放使用很难做到全覆盖。

随着人们生活水平的逐步提高，人们对食品的质量与安全要求越来越高，食源性致病微生物是引发食品安全事故的主要因素。据统计，在食源性疾病中，由致病菌引发的食物中毒是食品安全的主要问题，畜禽肉类产品是细菌性食源性疾病最主要的原因食品，而粮食类产品是导致死亡的主要食品。食源性疾病在全球是一个重要的公共卫生问题，是目前导致全球人类发病和死亡的重要原因。在美国食源性疾病每年导致5000人死亡，最新的数据显示，全球因腹泻病导致250万5岁以下儿童死亡，而且大多数发生在发展中国家。2015年第一季度我国病因明确的食源性疾病暴发起数占总暴发数的47％，由细菌污染导致的暴发占病因明确的食源性疾病暴发起数的33％。细菌性食源性疾病占主要部分(数据来源于国家食品安全风险评估中心)。