[发明专利]哺乳动物体细胞克隆方法和使用的培养液

说明书

本发明公开了一种哺乳动物例如牛或犬或羊的体细胞克隆方法和使用的培养液。其中哺乳动物体细胞克隆的方法包括以下处理哺乳动物体细胞克隆胚的步骤：1)将待移植的哺乳动物体细胞注入到去核后的卵母细胞并进行电融合，在电融合后1h，挑选成功融合的哺乳动物体细胞克隆胚进行激活处理；2)哺乳动物体细胞克隆胚在进行激活处理后，转移到G1.3培养液中进行培养。还涉及上述方法中使用的培养液。本发明方法呈现如说明书所述优异技术效果。

技术领域

本发明属于动物特别是哺乳动物体细胞克隆技术领域，涉及一种哺乳动物体细胞克隆胚的处理方法，例如涉及一种牛或犬体细胞克隆胚的处理方法，特别是涉及一种基于体细胞核移植构建的哺乳动物例如牛或犬体细胞克隆胚的处理方法。本发明哺乳动物例如牛或犬体细胞克隆胚的处理方法能够克服现有技术中存在的一种或多种缺陷并且呈现如本发明的述一个或多个方面的优点。

背景技术

哺乳动物体细胞克隆是一项具有巨大研究和商用价值的技术，可应用到治疗性克隆，疾病模型，人类器官移植，动物转基因研究，频临灭绝动物品种保护，优良家畜品种扩增等方面。但至今体细胞克隆效率仍然不高，显著制约着此技术的广泛应用。

目前认为，克隆效率低下的主要原因是供体哺乳动物体细胞核没有被受体卵胞质完全的重编程，即重编程失败或不完全。此重编程过程中没有涉及基因序列的变化，主要是表观遗传修饰的变化。表观遗传修饰主要包括组蛋白乙酰化和DNA甲基化两方面。

(2E)-5-[3-(Phenylsulfonylamino)phenyl]-pent-2-en-4-ynohydroxamicacid，中文名：(2E)-5-[3-(苯基磺酰基氨基)苯基]-戊-2-烯-4-炔异羟肟酸，又称为Oxamflatin，CAS151720-43-3，其是一种表观遗传修饰药物，是去组蛋白乙酰化酶的抑制剂。(2E)-5-[3-(Phenylsulfonylamino)phenyl]-pent-2-en-4-ynohydroxamic acid的化学结构式如下：

Oxamflatin为羟肟酸rC(OH)＝NOH的异构体。具微酸性，微溶于水。易水解为羧酸与羟胺。加热时发生洛森重排成异氰酸酯。与高价金属如铁等形成深色络合物。用酯与羟胺反应制取。Oxamflatin可以抑制去组蛋白乙酰化酶，从而提高组蛋白乙酰化水平。Oxamflatin已经有应用于肿瘤治疗的临床报道。

现有技术已有诸多关于哺乳动物例如牛或犬体细胞克隆胚的方法，然而这些技术仍然存在一种或多种技术缺陷。因此，本领域仍然期待有新的方法进行哺乳动物例如牛或犬体细胞克隆胚，例如仍然期待有新的方法进行哺乳动物例如牛或犬体细胞克隆胚的方法，例如基于体细胞核移植构建。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种新的方法来处理哺乳动物例如牛或犬体细胞克隆胚，例如提供一种基于体细胞核移植构建的处理哺乳动物例如牛或犬体细胞克隆胚的方法，例如，在哺乳动物例如牛或犬体细胞注入去核的卵母细胞并进行电融合之后，对融合后的牛或犬克隆胚用(2E)-5-[3-(苯基磺酰基氨基)苯基]-戊-2-烯-4-炔异羟肟酸进行处理，提高哺乳动物例如牛或犬体细胞克隆囊胚质量和发育率。本发明人出人意料的发现，通过使用本发明方法能够解决一种或多种现有技术中存在的不足。本发明基于此发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了一种哺乳动物体细胞克隆方法，该方法包括以下处理哺乳动物体细胞克隆胚的步骤：

1)将待移植的哺乳动物体细胞注入到去核后的卵母细胞并进行电融合，在电融合后1h，挑选成功融合的哺乳动物体细胞克隆胚进行以下激活处理：首先在含5μmol/L离子霉素的mSOF溶液中室温孵育4min，然后在含2mmol/L 6-DMAP和1μmol/L Oxamflatin的mSOF溶液中，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养4h；[6-DMAP系6-二甲基氨基嘌呤的简称]