[发明专利]一种提高多引物RCA特异性的方法

说明书

技术领域

本发明是基于对商品化多引物RCA试剂盒的改良，涉及一种提高改良多引物RCA特异性的方法。

背景技术

滚环扩增(Rolling circle amplification，多引物RCA)是1998年建立的一种体外等温核酸扩增方法。该方法借鉴了环状病原微生物DNA分子的滚环复制方式，实现环状DNA的高速循环复制。作为一种有效的DNA扩增工具，RCA具有很多的优势。如对设备要求低，操作简单，检测所有感染体中环型DNA成分，不需要知道任何的基因序列信息等特点。目前RCA技术已经被广泛的应用于DNA测序，蛋白质表达，生物传感器，诊断，药物发现和纳米技术等。

滚环扩增主要利用了具有稳定性强和链置换活性的DNA聚合酶，如Phi 29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶等。根据寡核苷酸引物的数量和种类，滚环扩增又可分为线性扩增(Linear多引物RCA，L多引物RCA)、指数扩增(Hyperbranched多引物RCA，H多引物RCA)、多引物滚环扩增(multiply-primed多引物RCA)和锁式探针扩增(Ligation-多引物RCA，L多引物RCA)等。其中，多引物RCA主要利用了Phi 29DNA聚合酶和引物六聚体，实现对不同的核酸分子进行扩增，如质粒、人工细菌染色体(Bacteria artificial chromosome,BAC)、粘粒等大的环状DNA等，同时也可以扩增未知序列的环状DNA和无法克隆的环状模板，产物为双链，可用于测序、酶切、克隆、标记和检测等方面，市售的TempliPhi^TMDNA测序模板扩增试剂盒即应用了多引物RCA技术。

多引物RCA技术已得到广泛应用，但该技术仍存在一定的不足。尤其是当反应体系中的DNA模板复杂或含量很低时，大量引物不能与模板有效配对，引物之间易形成二聚体结构，导致错配的产生，产生大量非特异性扩增产物，降低了目的DNA的滚环扩增效率。这一点，即使我们使用优化过的反应条件(比如：使用修改过的随机引物)，非特异性扩增产物也不能被完全消除，特别是，当多引物RCA体系中不含有或含有少量的DNA，非特异性扩增现象依然存在。目前，据文献报道，有一种利用突变的单链DNA结合蛋白TthSSB来改善多引物RCA扩增的方法。该方法是将突变TthSSB蛋白加入到市售的多引物RCA试剂盒体系中(TempliPhi^TMDNA测序模板扩增试剂盒)，提高了多引物RCA的扩增特异性同时消减了多引物RCA非特异性扩增的现象。因TthSSB蛋白具备单链结合蛋白(single-stranded nucleic acid binding protein，SSB)的特性，在多引物RCA反应过程中，通过与体系中的单链DNA结合，不仅使得单链DNA保持稳定，防止其重新配对成双链或被核酸酶降解，还能促进同源的核苷酸链互补配对，从而实现了对多引物RCA技术的优化。但是，该文献中没有明确的指出蛋白的用量，同时该方法需要先纯化出有活性的TthSSB蛋白，步骤繁琐、费时费力，价格昂贵，同时不利于运输和保存，在实际应用中相对困难。因此，本申请人对此进行深入研究，旨在开发一种容易应用，简单、廉价、快速、高效的提高多引物RCA扩增特异性的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高多引物RCA特异性的方法，该方法可高效地扩增目标核酸序列。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种提高多引物RCA特异性的方法，包括以下步骤：

(1)配置浓度为0.1mg/ml的PEG8000溶液，备用；

(2)变性：以pUC19-hupB重组质粒DNA作为模板，在5ul ddH₂O中加入1ng pUC19-hupB重组质粒DNA，混匀后，95℃加热3min，然后冷却至室温或4℃，获得变性样品液；

(3)培育：将2ul的2.5mM dNTP，2ul的10×BSA，1ul的phi29DNA聚合酶buffer，以及0.2ul的TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒中的Phi29DNA酶混合液，混匀，置于冰上，得到预混合酶液；将5ul预混合酶液加入所述变性样品液中，混匀，得到多引物RCA反应液；在此多引物RCA反应液中加入0～1.6ul的所述PEG8000溶液，然后于30℃下水浴4-18h；65℃加热10min，冷却至4℃，得到改良的多引物RCA扩增产物。