[发明专利]用于测量和校准多重PCR反应中的扩增偏倚的组合物和方法

权利要求书

1.一种用于测定一组寡核苷酸引物的成员中的非均一核酸扩增潜能的方法，所述一组寡核苷酸引物能够扩增生物样品中编码一种或多种适应性免疫受体的重排核酸分子，所述生物样品包含来自哺乳动物受试者的淋巴样细胞的重排核酸分子，所述方法包括：

(a)在多重PCR反应中使用所述寡核苷酸引物组扩增包含多种模板寡核苷酸的组合物，以获得多种扩增的模板寡核苷酸，其中各模板寡核苷酸沿5’-3’方向包含：

(i)包含适应性免疫受体可变(V)区编码基因序列或其互补序列的至少20个且不超过1000个连续核苷酸的V寡核苷酸序列，并且每种V寡核苷酸包含独特的V区寡核苷酸序列，和

(ii)包含适应性免疫受体连接(J)区编码基因序列或其互补序列的至少15个且不超过600个连续核苷酸的J寡核苷酸序列，并且每种J寡核苷酸序列包含独特的J区寡核苷酸序列；

和其中各模板寡核苷酸进一步包含一个或多个随机寡核苷酸序列；

且其中所述多种模板寡核苷酸包含至少a种或至少b种独特寡核苷酸序列，以较大者为准，其中a是所述受试者中的独特适应性免疫受体V区编码基因区段的数量并且b是所述受试者中的独特适应性免疫受体J区编码基因区段的数量，并且所述组合物包含至少一种针对每种独特V区寡核苷酸的模板寡核苷酸和至少一种针对每种独特J区核苷酸的模板寡核苷酸；

(b)对所述多种扩增的模板寡核苷酸进行测序，以对构成所述多种的每种独特模板寡核苷酸测定

(i)模板寡核苷酸序列，和

(ii)所述模板寡核苷酸序列的出现频率；以及

(c)将每种所述模板寡核苷酸序列的出现频率与预期分布进行比较，其中所述预期分布基于构成所述组合物的所述多种模板寡核苷酸的预定摩尔比，并且其中所述模板寡核苷酸序列的所述出现频率与所述预期分布之间的偏差指示所述寡核苷酸扩增引物组的成员间的非均一核酸扩增潜能。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述预定摩尔比是等摩尔。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述预期分布包括由所述寡核苷酸引物组扩增的所述多种模板寡核苷酸组的均一扩增水平。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，还包括对于相对于所述预期分布呈现非均一扩增潜能的所述寡核苷酸引物组的每个成员，调节所述寡核苷酸扩增引物组中的所述寡核苷酸引物成员的相对占比。

5.根据权利要求4所述的方法，其中调节：(a)包括增加所述寡核苷酸引物组中的所述成员的相对占比，从而修正所述寡核苷酸引物组的成员间的非均一核酸扩增潜能；或(b)降低所述寡核苷酸引物组中的所述成员的相对占比，从而修正所述寡核苷酸引物组的成员间的非均一核酸扩增潜能。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，还包括对于相对于所述预期分布呈现非均一扩增潜能的所述寡核苷酸扩增引物组的每个成员，计算所述扩增的模板核酸分子的成比例增加或减小的出现频率，从而修正所述寡核苷酸引物组的成员间的非均一核酸扩增潜能。

7.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中每种扩增的模板核酸分子的长度小于1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、90、80或70个核苷酸。

8.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸引物组不包括特异性杂交至V区假基因或孤独基因或者杂交至J区假基因或孤独基因的寡核苷酸引物。