[发明专利]一株杂交瘤细胞株及其在含乳饮料中酪蛋白含量检测中的应用

权利要求书

1.一株杂交瘤细胞株CA-5T8，保藏编号为CGMCC No.14301，分类命名为抗酪蛋白单克隆抗体细胞株，保藏日期为2017 年6月14日，保藏地址：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所。

2.权利要求1所述杂交瘤细胞株CA-5T8分泌得到的单克隆抗体，其特征在于：该单克隆抗体为抗酪蛋白抗体，能同时识别α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白。

3.权利要求2所述杂交瘤细胞株CA-5T8分泌得到的单克隆抗体的应用，其特征在于：将其制备成酪蛋白含量检测试纸条，应用于含乳饮料中酪蛋白含量检测中。

4.根据权利要求3所述杂交瘤细胞株CA-5T8分泌得到的单克隆抗体的应用，其特征在于步骤如下：组装含乳饮料中酪蛋白含量检测试纸条，将单克隆抗体制备成金标抗体，随后在室温，即19~25℃下进行测量；

具体为：将含乳饮料样品稀释10倍后取100μL，将试纸条的样品垫浸入样品液，金标酪蛋白抗体随样品液在虹吸作用下向吸水垫一端流动，反应在5min内即可判断捡测结果，且30min内，显色结果不会发生变化。

5.根据权利要求4所述杂交瘤细胞株CA-5T8分泌得到的单克隆抗体的应用，其特征在于检测结果判断如下：

样品中不含酪蛋白，金标抗体与检测线的酪蛋白结合，金粒子在检测线堆积，呈现红色可见条带；

样品中含有酪蛋白，会与检测线处的酪蛋白竞争结合金标抗体，堆积的金粒子减少，检测线显色变浅；

样品中酪蛋白含量达到或超过试纸条预设的检测限，金标抗体被样品中的酪蛋白饱和，检测线处不显色；

质控线呈现红色清晰条带，表明检测试纸条有效；反之，表明试纸条失效。

6.根据权利要求3所述杂交瘤细胞株CA-5T8分泌得到的单克隆抗体的应用，其特征在于所述含乳饮料中酪蛋白含量检测试纸条的制备：

（1）胶体金的制备：参考柠檬酸三钠还原法，在500mL三角烧瓶中加入超纯水，加入2～10mL 4g/L的氯金酸溶液，搅拌加热，溶液沸腾后继续加热30min，然后迅速加入2～5mL 质量浓度为2%的柠檬酸三钠溶液，继续加热保持煮沸状态，溶液颜色由无色转化成暗黑色，再转变为紫红色，室温冷却，得到胶体金溶液，锡箔纸封口4℃保存备用；

（2）金标抗体的制备：取步骤（1）制备所得50～100mL胶体金溶液，加入200μL 0.1MK₂CO₃溶液，混匀；将权利要求2所述抗体用2mM、pH为8.2的硼酸盐缓冲溶液将抗体稀释为0.1～1mg/mL；在胶体金溶液中加入120μg稀释后的抗体，置于摇床上振荡标记1～3h，再加入5mL质量浓度为10%的BSA溶液，混匀继续振动反应1h，最终的金标偶联物在8000rpm离心50min，去上清，用2/3原体积的洗涤液复溶，再次离心，最终用1/10原体积的金标重悬液复溶，置4℃保存，得到金标酪蛋白抗体；

（3）金标试纸条的组装：

a、金标垫准备：将步骤（2）所得金标酪蛋白抗体用金标重悬液稀释到合适浓度，浸泡金标垫，37℃烘1h备用；

b、硝酸纤维膜的准备：用金标喷膜仪将0.1～1mg/mL酪蛋白及羊抗鼠二抗分别喷在T线及C线上，作为检测线及控制线，37℃烘箱干燥12h备用；

c、组装：在硝酸纤维素膜（3）一端搭接吸水垫（1），另一端搭接样品垫（2），样品垫（2）与硝酸纤维素膜（3）之间搭接金标垫（4）；所述硝酸纤维素膜（3）靠近样品垫（2）的一端设置检测线T线（5），靠近吸水垫（1）一端设置控制线C线（6），即得到成品含乳饮料中酪蛋白含量检测试纸条。