[发明专利]一种草鱼肠巨噬细胞的分离、纯化与原代培养方法

权利要求书

1.一种草鱼肠巨噬细胞的分离方法，其特征在于包括以下步骤：

S1、在无菌环境下，获得健康草鱼中后段肠道之后对所述肠道做预处理，所述预处理的操作为：将所述肠道外脂肪与肠系膜除去，纵向剖开肠管并清除粪便，之后刮除肠道黏液以及上皮细胞层，最后用PBS缓冲液振荡清洗，得到肠壁明显变薄且肠壁颜色变为淡黄色至白色的肠段；

S2、将所述肠段充分处理成碎块，并加入到胶原酶IV消化液中进行振荡消化，消化结束后过滤得到滤液，将所述滤液进行离心处理获得细胞沉淀物，将所述细胞沉淀物配制成肠黏膜固有层单细胞悬液；

S3、从所述肠黏膜固有层单细胞悬液中分离得到肠巨噬细胞；

所述步骤S1中健康草鱼中后段肠道的获取操作为：用自来水冲洗健康草鱼的体表后敲打草鱼头部致死，立即放入75％乙醇中浸泡20s，取出肠道中后段；所述预处理在含有预冷的PBS缓冲液的培养皿中进行，肠段用PBS缓冲液振荡清洗3次，所述PBS缓冲液的浓度0.01mol/L，pH7.4；

所述步骤S1中，采用无菌弯头镊子刮除肠黏液与上皮细胞层；

所述步骤S2中碎块的体积＜1mm³，所述碎块置于胶原酶IV消化液中放入28℃振荡培养箱振荡消化2h，所述振荡培养箱的转速为250转/分钟；消化结束将所述胶原酶IV消化液过400目筛网获得滤液，之后将所述滤液以1800rpm离心8min并收集细胞沉淀物，使用Hank's平衡液洗涤所述细胞沉淀物，并使用所述Hank's平衡液将所述细胞沉淀物配成浓度为1×10⁸个/mL的肠黏膜固有层单细胞悬液；

所述的胶原酶IV消化液由Hank’s平衡液、胎牛血清以及胶原酶IV组成，所述胎牛血清在胶原酶IV消化液中的质量浓度为1.7mg/mL，所述Hank’s平衡液在胶原酶IV消化液中的体积百分数为95％，所述胎牛血清在胶原酶IV消化液中的体积百分数为5％；

步骤S3具体为：

在15mL离心管中依次缓慢加入3mL分离液1，2mL分离液2，制成梯度界面；吸取5mL上述制好的单细胞悬液加在分离液液面上，1800rpm/min离心30min，此时离心管内容物被分为五层，由上而下依次是稀释液层、环状乳白色上层、环状乳白色下层、分离液层和红细胞层；用巴氏吸管小心吸取环状乳白色上层至另一15mL离心管中，用Hank's平衡液洗3次，1800rpm/min离心8min，弃上清，用1mL RPMI 1640基础培养液培养液重悬细胞沉淀；

所述RPMI 1640基础培养液由RPMI 1640培养液、胎牛血清以及抗微生物液组成，所述RPMI 1640培养液、胎牛血清以及抗微生物液在RPMI 1640基础培养液中的体积百分数分别为94％、5％、1％。

2.一种如权利要求1所述草鱼肠巨噬细胞的纯化方法，其特征在于：用RPMI 1640基础培养液将所述肠巨噬细胞稀释后接种于细胞培养板并在培养箱中培养，培养4h后进行第一次换液，继续培养至12h后进行第二次换液，最终获得纯化后的草鱼肠巨噬细胞；换液时弃去全部陈旧培养液并加入新鲜的含草鱼自体血清的RPMI 1640完全培养液。

3.如权利要求2所述草鱼肠巨噬细胞的纯化方法，其特征在于：所述肠巨噬细胞稀释后浓度为3×10⁶个/mL；所述细胞培养板为96孔细胞培养板，所述细胞培养板接种量为100μL/孔；所述培养箱内温度28℃、CO₂体积含量5％。

4.如权利要求1所述草鱼肠巨噬细胞的纯化方法，其特征在于：所述的含草鱼自体血清的RPMI 1640完全培养液由RPMI 1640培养液、胎牛血清、草鱼自体血清以及抗微生物液构成，所述RPMI 1640培养液、胎牛血清、草鱼自体血清以及抗微生物液在RPMI 1640完全培养液中的体积百分数分别为84％、10％、5％、1％。