[发明专利]一种利用超声波处理提高超低温保存的海伦兜兰种子萌发率的方法

说明书

技术领域：

本发明属于植物保护生物学和生物技术领域，具体涉及一种利用超声波处理提高超低温保存的海伦兜兰种子萌发率的方法。

背景技术：

海伦兜兰(Paphiopedilum helenae Aver.)又称巧花兜兰，分布于我国广西西部和越南北部，生长在灌木丛生的石灰岩山地岩壁缝隙中，分布范围狭窄，是一种十分珍稀的兜兰属植物；同时，由于其生境的破坏和人工采挖，其野生植物数量已极为稀少，被《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)列入附录I而禁止交易，被世界自然保护联盟(IUCN)红色名录中列为极危物种(CR)亟待保护，在中国也已被中国国家林业局列为极小种群野生植物需要重点保护。海伦兜兰种子的超低温保存是其种质保存最有效的方法之一，但经过低温保存的海伦兜兰种子的萌发率极低。因此，如何提高超低温保存的海伦兜兰种子萌发率是目前亟需解决的技术难题。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种利用超声波处理提高超低温保存的海伦兜兰种子萌发率的方法。

本发明的利用超声波处理提高超低温保存的海伦兜兰种子萌发率的方法，包括以下步骤：将超低温保存的海伦兜兰(Paphiopedilum helenae Aver.)种子迅速放入38℃-42℃的水浴中解冻1-3分钟，无菌条件下将种子放入无菌水中，摇匀后超声波处理4-8分钟，过滤后将种子播种到种子萌发培养基中培养。

所述的将种子播种到种子萌发培养基中培养，其培养条件为培养温度26℃-30℃，光照度2000-3000lx，光照12-14小时/天，所述的种子萌发培养基的配方为：每升含有萘乙酸0.5-1.5mg、活性炭1.0-2.0g、琼脂5.5-6.0g和蔗糖15-20g，余量为1/4MS培养基，其每升配制方法是将萘乙酸0.5-1.5mg，活性炭1.0-2.0g，蔗糖15-20g和琼脂5.5-6.0g加入到少量的1/4MS培养基，混合均匀然后用1/4MS培养基定容至1L，灭菌即得。

MS培养基为国际通用的培养基，其成份和配置方法见Murashige T,Skoog F(1962)(A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.Physiol Plant.15:473–497)。1/4MS培养基是指将MS培养基中大量元素浓度减至原来的1/4，其余成分浓度不变而形成的培养基。

所述的超声波处理，其超声波频率优选为40KHZ，功率优选为750W。

优选，所述的超低温保存具体为：选择生长健壮的兜兰植株在花期进行人工自交授粉，授粉后7-9个月内采集成熟还未开裂的蒴果，将蒴果进行消毒处理，无菌条件下切开蒴果，将粉末状成熟的种子脱水至种子含水量为8％-15％，然后将种子装入冷冻管中再投入液氮中保存。

所述的将蒴果进行消毒处理具体为：在超净工作台上将蒴果用体积分数70％-80％的酒精浸泡30-60秒后用质量分数0.1％-0.2％的升汞溶液消毒10-20分钟，无菌水漂洗4～6次。

所述的将粉末状成熟的种子脱水至种子含水量为8％-15％具体为：将经过干燥处理的变色硅胶放入已灭菌的培养皿中，然后在变色硅胶上面放上无菌滤纸，再将粉末状成熟的种子放到无菌滤纸上，用封口膜封好培养皿后脱水48-96小时。

利用本发明的利用超声波处理提高超低温保存的海伦兜兰种子萌发率的方法，能显著提高超低温保存12-24个月的兜兰种子萌发率，种子萌发率从3％-5％提高到35％-50％，从而实现对海伦兜兰种子的有效保护，为海伦兜兰的种质资源保护和开发利用奠定基础。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

实施例1：

(1)种子的采集和超低温保存