[发明专利]一种酶交联水凝胶的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于水凝胶技术领域，尤其涉及一种酶交联水凝胶的制备方法及其应用。

背景技术

可注射性水凝胶基于的支架材料包括天然高分子材料和合成高分子材料，如胶原、壳聚糖海藻酸、透明质酸及聚乙二醇(PEO)、聚乳酸(PLA)等。其在原位“溶胶-凝胶”转变成型的方式一般有温敏交联、化学交联(Michal加成交联、自由基交联、离子交联、光交联等)以及酶交联等。

温敏性交联的水凝胶主要是通过温度的改变发生“溶胶-凝胶”的转变，分为降温型转变和升温型转变。虽然其转变过程中不需添加其他添加剂，但是其转变方式需依赖一定的温度。化学交联是将带有光敏性或不饱和官能团的前驱物在离子、光照或交联因子的作用下发生自由基聚合或氧化还原反应进而发生交联反应。虽然其交联速度相对较快，但是该凝胶方式可能会引起水凝胶体系的pH值的变化，并伴随着副产物的毒性问题。其中光交联中的UV光引发聚合方式可能会损伤组织，且UV光的透过率有限，不适用于较深组织的修复。

发明内容

针对现有技术中的上述问题，本发明的主要目的在于提供一种酶交联水凝胶的制备方法，得到了一种温和的酶促交联自聚合水凝胶，具有优异生物相容性，克服了现有水凝胶中化学交联因子残留于体系或光交联引起的毒副作用等缺点。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种酶交联水凝胶的制备方法，所述方法包括如下步骤：将CS-C(儿茶酚改性的壳聚糖)分别溶于0.06wt％的H₂O₂溶液及0.004wt％的HRP酶溶液(辣根过氧化物酶)中，得到1.5-1.8wt％的CS-C的H₂O₂溶液和CS-C的HRP酶溶液；分别将CS-C的H₂O₂溶液和CS-C的HRP酶溶液加入到Y型注射器中进行混合注射，在凝胶模具中形成凝胶。

作为进一步的优选，所述凝胶模具为底部锯掉的EP管，形成凝胶的时间为150s。

作为进一步的优选，所述CS-C的制备方法包括：

1)将CS(壳聚糖)溶解于酸液中，搅拌得到CS溶液；调节所述CS溶液至pH＝5.0后，再将CHA(3,4-二羟苯基丙酸)加入到所述CS溶液中，CHA和CS的摩尔比为0.8～1，搅拌至澄清，得到溶液A；

2)将EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶解于第一溶剂中，得到溶液，将所述溶液逐滴加入到溶液A中，搅拌，使其充分混合；EDC和CHA的摩尔比为1-2，偶联反应12-24h，并保持pH＝5，温度37℃；反应结束后，透析除去反应物质及副产物，冻干得到CS-C(儿茶酚改性接枝的壳聚糖)。

作为进一步的优选，所述步骤1)中，所述酸液为pH＝1～2的HCl溶液，所述搅拌时间为4-6h。

作为进一步的优选，所述步骤2)中，所述第一溶剂为乙醇。

作为进一步的优选，所述步骤2)中，控制滴加的速率为以1滴/秒。

作为进一步的优选，所述步骤2)中，所述透析包括：依次置于含有1wt％的NaCl、pH＝5.0的HCl溶液和去离子水中透析。

本发明的另一目的还在于提供了一种酶交联水凝胶的应用，所述水凝胶可负载人诱导多能干细胞。

作为进一步的优选，所述水凝胶负载人诱导多能干细胞的方法包括：将15-18mg的CS-C分别溶于1mL0.06wt％的H₂O₂溶液及1mL0.004wt％的HRP酶溶液中，得到CS-C的H₂O₂溶液和CS-C的HRP酶溶液；将所述CS-C的H₂O₂溶液和CS-C的HRP酶溶液预混，得到预混液；在预混液未完全凝胶之前，加入0.2～0.3mLiPSC(4×10⁶个/mL)的细胞悬液到所述预混液中，轻柔混合均匀后，在37℃，5％CO₂培养箱中培养3天。