[发明专利]一种恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种非诊断目的的恒温条件下合成核酸的方法，包括以下步骤：

1)提供一种核酸，所述核酸的5’末端具有可与同一条链上的N区退火的Nc区，同时该核酸的3’末端具有可与同一条链上的N区退火的Nc区，此核酸的5’末端和3’末端所具有的Nc区与同一链上的N区退火存在竞争关系；

2)以步骤1)所述核酸为模板，将已与N区退火的Nc区的3’端为合成起点，合成其自身的互补核酸链；

3)通过聚合酶催化链置换型互补链合成反应进行互补链合成，以置换步骤2)中所合成的互补核酸链。

2.根据权利要求1所述的一种恒温条件下合成核酸的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

1)提供一种核酸的步骤，该核酸的5’末端和3’末端均具有能够与同一条链上的N区退火的Nc区；所述3’末端的Nc区与N区退火时能形成环，所述环包含能进行碱基配对的F1c区；所述5’末端的Nc区与N区退火时能形成环，所述环包含能进行碱基配对的R1区；所述核酸的5’末端和3’末端所具有的Nc区与同一链上的N区的退火存在竞争关系；

2)使第一寡核苷酸I与步骤1)提供的所述核酸的F1c区退火，然后以所述第一寡核苷酸I的F1区作为合成起点，进行合成步骤；其中所述第一寡核苷酸I包括N区与Fl区；

3)以步骤1)提供的所述核酸为模板合成其自身的互补链，将已与N区退火的Nc区的3’端为合成起点；将合成完后的核酸序列称为核酸A；

4)使第二寡核苷酸II与步骤3)提供的所述核酸A的R1c区退火，然后以所述第二寡核苷酸II的R1区作为合成起点，进行合成步骤；其中所述第二寡核苷酸II包括R1区和Nc区；

5)以步骤3)提供的所述核酸A为模板合成其自身的互补链，将3’端已与Nc区退火的N区为合成起点，获得在其一条链上具有首尾互补核苷酸序列的核酸链，并且该核酸链上具有交替连接的互补核苷酸序列区。

3.根据权利要求1所述的恒温条件下合成核酸的方法，其特征在于，步骤1)所述核酸的制备方法，包括以下步骤：

1-1)退火步骤，使第一寡核苷酸I与模板的F1c区退火，其中所述模板的3’末端包括F1c区和位于F1c区5’侧的N区，该模板的5’末端包括R1区，其中所述第一寡核苷酸I包括N区与Fl区，所述N区与F1区的5’侧相连，其中，

F1区：具有与F1c区互补的核苷酸序列的区，

N区：与Nc区互补的核苷酸序列的区；

1-2)以所述第一寡核苷酸I的F1区作为合成起点，合成第一核酸；所述第一核酸具有与所述模板互补的核苷酸序列，所述第一核酸的5’末端具有可与同一条链上的Nc区退火的N区，并且通过所述Nc区与N区的退火可形成茎环；

1-3)利用聚合酶催化链置换反应置换获得步骤1-2)所合成的第一核酸；

1-4)退火步骤，使第二寡核苷酸II与步骤1-3)所得第一核酸的R1c区退火，其中所述第二寡核苷酸II包括R1区和Nc区，并且Nc区与R1区的5’侧相连；其中，

R1区：具有与R1c区互补的核苷酸序列的区，

Nc区：与N区互补的核苷酸序列的区；

1-5)以所述第二寡核苷酸II的R1区作为合成的起点，合成第二核酸；

1-6)利用聚合酶催化链置换反应置换所述第二核酸获得步骤1)所述的核酸。

4.根据权利要求3所述的恒温条件下合成核酸的方法，其特征在于：步骤1-1)所述模板为RNA，步骤1-2)中的第一核酸通过具有反转录酶活性的酶来合成。

5.根据权利要求2-4任一项所述的恒温条件下合成核酸的方法，其特征在于：所述F1c区、N区和R1区的核酸片段均为15-60bp。

6.根据权利要求1或2所述的恒温条件下合成核酸的方法，其特征在于：所述获得的核酸链能够自主配对无限延伸，该核酸链上3’端的Nc区会与该链上的互补区段N区配对作为合成起点以自身为模板使所述核酸链不断延伸。