[发明专利]靶向抑制沙门氏菌耐药外排泵基因acrA的siRNA-DNA纳米系统及其制备方法

说明书

本发明属于微生物耐药性研究技术领域，提供一种靶向抑制沙门氏菌耐药外排泵基因acrA的siRNA‑DNA纳米系统及其制备方法。具体提供一种DNA纳米载体，其为由寡核苷酸A单链、寡核苷酸B单链和寡核苷酸C单链组装而成的类四面体结构。在此基础上，本发明还提供DNA纳米载体负载siRNA靶向外排泵基因组成的纳米系统、制备方法及应用。本发明DNA纳米载体具有类四面体结构，其上能够稳定负载siRNA，并能将其安全、快速、高效地运输到靶细胞，以抑制沙门氏菌外排泵基因表达，提高了沙门氏菌对抗生素的敏感性，进而有效抑制沙门氏菌耐药性。

技术领域

本发明属于微生物耐药性研究技术领域，具体涉及一种DNA纳米载体、靶向抑制沙门氏菌耐药外排泵基因acrA的siRNA-DNA纳米系统、其制备方法及应用。

背景技术

沙门氏菌是一类非常重要的革兰氏阴性菌，能引起人畜共患疾病。革兰氏阴性菌，尤其是沙门氏菌抗生素耐药问题不断加重，已成为全球关注的热点之一。由于多重耐药革兰氏阴性菌的不断蔓延，针对细菌感染的抗生素治疗的失败案例逐渐增多。世界卫生组织(WHO)宣称，耐药细菌已经成为威胁人类健康的主要因素之一，从而使寻找解决细菌耐药性的方法变得更加紧迫且具有意义。研究表明，外排泵可将多种抗生素排出细菌胞外，且多重耐药与广泛存在于革兰氏阴性菌中的RND外排泵过表达相关。因此，外排泵可开发为逆转耐药的潜在药物作用靶标。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一个高度有效的调控过程，导致转录后基因的沉默。该过程是由一段长度为21-23nt的短RNA双链，即小干扰RNA(siRNA)介导。目前，siRNA已经应用于多种基因的沉默，甚至疾病的治疗，包括病毒感染和癌症，但应用于细菌基因沉默的研究报道较少。由于裸露的siRNA容易降解、不稳定，有效作用时间短，为延长siRNA的作用时间，目前siRNA沉默细菌基因大都用表达载体或转染试剂进行递送，但该方法实验周期长、试剂昂贵，不具有靶向性，需要高浓度过量的siRNA，且容易导致脱靶。

基于以上背景技术现状，如何将siRNA安全、快速、高效地运输到靶细胞是一个亟待研究的课题。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明的首要目的是提供一种DNA纳米载体。该DNA纳米载体具有类四面体结构，其上能够稳定负载siRNA，并能将其安全、快速、高效地运输到靶细胞，以抑制沙门氏菌外排泵基因表达，提高了沙门氏菌对抗生素的敏感性，进而有效抑制沙门氏菌耐药性。

根据本发明的具体实施方式，本发明的DNA纳米载体，其为由寡核苷酸A单链、寡核苷酸B单链和寡核苷酸C单链组装而成的类四面体结构，所述寡核苷酸A单链的碱基序列如SEQ ID NO:1所示，所述寡核苷酸B单链的碱基序列如SEQ ID NO:2所示，所述寡核苷酸C单链的碱基序列如SEQ ID NO:3所示。

根据本发明的具体实施方式，本发明的另一目的是提供所述DNA纳米载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)准备原料：分别合成所述寡核苷酸A单链、寡核苷酸B单链和寡核苷酸C单链，然后分别加入一定量的ddH₂O，配制成200nM溶液作为原料备用，准备好的各原料如下表所示：