[发明专利]一种诱导桃儿七体细胞胚发生的方法

说明书

本发明提供了一种诱导桃儿七体细胞胚发生的方法，涉及组织培养技术领域。包括以下操作步骤：(1)无菌试管苗的诱导；(2)胚性愈伤组织的分化；(3)体细胞胚的诱导；(4)体细胞胚的同步化调控及增殖培养，获得大量桃儿七体细胞胚丛生芽。本发明提供的方法得到的体细胞胚丛生芽诱导率达75％以上，再生种苗存活率达85％以上。本发明提供的方法操作工艺简单，不受时间、季节限制，可以在室内工厂化生产桃儿七体细胞胚再生种苗以供生产栽培需要。

技术领域

本发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种桃儿七体细胞胚发生的方法。

背景技术

桃儿七Sinopodophyllum emodi(Wall.)Ying为小檗科桃儿七属多年生草本植物，主要分布于东喜马拉雅及临近地区，是我国传统名贵濒危中药材之一，主要用于痛疖肿毒、风湿性骨痛、气管炎等症，近年来研究发现其根和根状茎中含有大量的具有抗癌活性的木脂素类化合物，其中鬼臼毒素抗癌活性最高，是合成GP7，VP16和VM-26等抗癌药物的前体化合物，具有非常广阔的应用前景。桃儿七药材目前主要依赖于野生资源，随需求量的日益增加，过度采挖使桃儿七资源日益减少，目前已被列入《中华珍稀濒危植物名录》，是国家三级濒危中药材。

宁夏农林科学院农业生物技术研究中心从2014年开始对桃儿七种苗繁育进行研究，发现桃儿七种子具有一定的休眠和后熟特性，自然条件下种子发芽率不到10％，，种子幼苗的生长对环境要求比较苛刻，无法满足规模化人工栽培的需求。植物体细胞胚胎发生技术是植物无性繁殖的重要途径，通过组织培养，能够提供繁殖数量大、繁殖速度快，后代遗传稳定的体细胞胚，植物体细胞胚具有和种子相同的形态发生潜力，是最有发展前景的无性繁殖方法之一。

桃儿七体细胞胚的发生技术为解决桃儿七种子、种苗匮乏和种质资源保存的问题提供了一个重要的方法和手段。目前，桃儿七组织培养工作已经开展，甘肃农业大学栗孟飞等以桃儿七成熟合子胚直接进行无菌苗繁育，获得了桃儿七无菌苗，但是一个合子胚只能产生一颗苗，诱导率低，桃儿七种子资源匮乏，不能满足桃儿七种苗的规模化生产。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种诱导率高的桃儿七体细胞胚发生的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种诱导桃儿七体细胞胚发生的方法，包括以下步骤：

1)将消毒后的桃儿七种子接种于种子培养基上进行暗培养5～7d，得到种胚，所述种子培养基为MS固体培养基，pH值为5.8；

2)将步骤1)得到的种胚接种于幼苗诱导培养基上进行幼苗诱导培养32～37d，得桃儿七无菌苗，所述幼苗诱导培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括5.0mg/L的GA3、20g/L的蔗糖和4.55g/L的琼脂，所述幼苗诱导培养基的pH值为5.6～5.8；

3)切取步骤2)得到的所述桃儿七无菌苗的下胚轴作为外植体，接入愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织培养，培养19～21d得到愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括1.0mg/L的2,4-D、1.0mg/L的KT、0.1～0.5mg/L的NAA、4.55g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH为5.6～5.8；

4)将步骤3)得到的愈伤组织接种于胚性愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织胚性诱导培养40～50d，得到胚性愈伤组织；所述胚性愈伤组织诱导培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括1.0mg/L的6-BA、1.0mg/L的GA3、0.1mg/L的IAA、300mg/L的水解酪蛋白、4.55g/L的琼脂和40g/L的蔗糖，pH值为5.6～6.2；