[发明专利]一株抗黄瓜枯萎病的贝莱斯芽胞杆菌及其微胶囊缓释菌剂

说明书

技术领域

本发明属于微生物及农业病害防治领域，具体涉及一株抗黄瓜枯萎病的贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)，本发明还涉及该菌株的应用及含有该菌株的微生物菌剂。

背景技术

黄瓜枯萎病，又名死秧病，是一种土传真菌病害。枯萎病对黄瓜的产量和品质影响很大，染病后会导致黄瓜苗大面积萎蔫，发病严重情况下可导致整株死亡，发病轻的时候可使黄瓜产量减少25％-35％，发病重的年份可造成绝产。

目前，黄瓜枯萎病的防治仍无十分有效的措施，生产上主要采取农业防治、生物防治和化学防治相结合的综合防治方针，将枯萎病发病高峰推迟至采收后期，从而减少损失。生物防治具有经济、安全无公害、长效等特点，是防治枯萎病研究的热门方向。目前研究的生物防治种类主要包括微生物源和植物源的生物防治，其中利用拮抗微生物防治植物病害已成为研究的重要方向。

相比于其它方法，生物防治虽具有一定的优势，但同时也存在一些不足。生防菌的应用受制于土壤环境等多种生态因素的制约，难以发挥较好的作用。对于传统农药剂型，由于药物在环境中的降解、挥发以及在土壤中的浸出问题，往往施药量比实际所需药量大，相应地，经济成本也更高。利用缓释剂对农药的控制释放是改善和解决这些问题的重要途径之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够拮抗黄瓜枯萎病，且在黄瓜根茎组织中具有良好定殖能力的贝莱斯芽胞杆菌，此外，本发明还提供一种用于拮抗黄瓜枯萎病的微生物菌剂及其制备方法，以便更好地将该菌株应用于黄瓜枯萎病的防治。

为实现上述目的，本发明采取了以下技术措施：

从黄瓜枯萎病发病区域中健康的黄瓜根、茎中分离出内生菌，采用平板对峙法获得1株对尖孢镰刀菌具有明显拮抗作用的贝莱斯芽胞杆菌菌株，将其命名为NH-1，并对该芽胞杆菌的48h发酵上清液进行115℃灭菌处理10min后进行平板抑菌实验，发现NH-1菌株高温处理后的发酵液对尖孢镰刀菌仍有拮抗作用。经gyrB基因序列分析并构建系统发育树鉴定NH-1菌株为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)。

通过利福平梯度筛选获得NH-1抗60μg/ml利福平菌株，并对其发酵48h进行盆栽灌根定殖试验，分别在7d，14d，21d，28d，45d检测黄瓜苗根茎及植株根际土中NH-1菌株的活菌浓度。结果发现，在黄瓜苗根、茎中NH-1以高于1×10⁶CFU/g的生物量保持稳定且呈上升的趋势，在根际土壤中的活菌数较稳定增殖，保持在10⁸CFU/g的数量级。

检测NH-1对黄瓜苗植株的防御保护酶体系PAL，PPO，POD的影响，检测到对黄瓜苗浇灌NH-1菌株的发酵液对其体内的PAL，PPO，POD酶活均具有显著的促进作用。

通过田间小区试验验证，贝莱斯芽胞杆菌NH-1田间防治效果高达66.03％，对比于不施加生防菌黄瓜苗植株的病情指数为92，施加了NH-1菌株发酵液的植株病情指数为26，田间数据显示，NH-1在防治黄瓜枯萎病上具有显著效果，是一种优势生防菌株。

利用微生物细胞固定化技术，我们将贝莱斯芽胞杆菌NH-1包裹在膜性壁材中得到的微胶囊缓释剂型，其优选的制备方法包括以下步骤：

(1)将贝莱斯芽胞杆菌NH-1在LB固体培养基中过夜活化后，以0.5～2％的重量比接种于新鲜的LB液体培养基中，于37℃，150～200rpm下培养，收集菌液；

(2)将菌液按1～4∶5的体积比加入到重量浓度为1～5％的海藻酸钠溶液中，充分搅拌后用注射器注入到冷却的pH为5～7、重量浓度为1～3％的金属盐溶液中，搅拌固化，将沉淀用水洗涤，干燥，即得。

进一步优选的制备方法是：

(1)将贝莱斯芽胞杆菌NH-1在LB固体培养基中过夜活化后，以1％的重量比接种于新鲜的LB液体培养基中，于37℃，180rpm下培养，收集菌液；

(2)将菌液按2∶5的体积比加入到重量浓度为3％的海藻酸钠溶液中，充分搅拌后用注射器注入到冷却的pH为5.5、重量浓度为2％的氯化钙溶液中，搅拌固化，将沉淀用水洗涤，干燥，即得。

通过土壤定殖实验可知，无论在营养基质中还是在自然土壤中，微胶囊菌剂都具有缓慢释放活菌数的趋势，到最后微胶囊崩解，营养基质中活菌数定殖达10⁶CFU/g，自然土壤中活菌数可达10⁷CFU/g。

本发明的有益效果是：