[发明专利]一种制作空心菜根结巨型细胞石蜡切片的方法

说明书

技术领域

本发明涉及石蜡切片的制作方法，具体涉及一种制作空心菜根结巨型细胞石蜡切片的方法。

背景技术

根结线虫是农业生产上严重的农作物线虫病害，给全世界的蔬菜、果树和粮食作物生产带来巨大的经济损失。根结线虫侵染寄主植物细胞，植物本身会发生复杂多变的病生理变化，根结中诱导产生多个巨型细胞。

目前对根结线虫的防治主要采用传统的方法，防治较为困难。随着分子生物学的日趋成熟，通过分子生物学技术深入研究根结线虫与其寄主植物巨型细胞的分子互作机理，培育新型的转基因抗线虫作物，从根本上切断根结线虫的侵染途径，从而对根结线虫进行防治成为努力方向，因此揭示巨型细胞的发育过程至关重要。

观察巨型细胞的发育过程常常需要用到石蜡切片。一张质量优良的切片必须具备完整、组织面平整、厚薄适当、染色清晰和反差强的特点。石蜡切片沿用多年，已经形成较为成熟的操作步骤，但在制作石蜡切片时，也会遇到脱片、切片碎裂、蜡带不连续、切片褶皱、染色效果不佳、模糊不清及细胞结构染色对比不明显等现象，极其影响后期观察。

石蜡切片中每一环节都具相关性，环环相扣，制作出优质切片，每一步都至关重要，任何一个环节操作不规范，都有可能影响最终的片子质量。影响片子质量的的因素有很多，不仅受组织本身特性的影响，还受标本的取材、组织块固定、脱水、包埋、浸蜡、切片、染色等因素的影响，因此需要针对每种材料的特点，建立适合的石蜡切片技术。

空心菜是一种理想的根结线虫寄主植物，空心菜接种南方根结线虫后，生长周期可超过6个月；因此可以利用空心菜研究根结线虫的重复侵染机理。而研究重复侵染机理，需要借助石蜡切片技术，观察空心菜根结巨型细胞的发育过程。

虽然植物组织石蜡切片的基本步骤相同，但是由于植物组织的具体特点不同，针对一种特定植物组织，需要建立具体的石蜡切片技术。到目前为止，尚未见空心菜根结巨型细胞石蜡切片技术的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制作空心菜根结巨型细胞石蜡切片的方法，该方法在常规石蜡切片技术上，针对空心菜材料的组织特点和根结巨型细胞的发育特点，对染色、横切切片角度和脱蜡等步骤进行了摸索和改进，提供了适合于观察巨型细胞发育过程的石蜡切片制作方法，同时克服了脱蜡剂对制作人员的毒害、根结内巨型细胞细胞核不清楚、切片内难以同时获得根结线虫和巨型细胞等缺点。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种制作空心菜根结巨型细胞石蜡切片的方法，包括以下步骤：

(1)抽真空和固定

将空心菜根结切成0.5-1cm的小段材料；把FAA固定液和材料放入注射器，推动抽筒排尽空气，然后手指按住针头插孔，另一只手推拔抽筒若干次，将材料内的空气抽出；然后材料置于FAA固定液中固定24h以上，至材料下沉为止；

步骤(1)所述的固定，固定期间更换一次固定液，以保证固定液维持一定的浓度；

(2)染色

将材料清洗干净，接着把材料置于2％丙酸溶液中浸泡48h以上，然后转移至爱利氏苏木精染液中浸泡4d以上，最后将材料清洗干净；

步骤(2)所述的将材料清洗干净，是先用流水冲洗24h以上，再用蒸馏水浸洗1h以上；

所述的流水冲洗，是将材料置于两端开口的指形筒中，两端分别盖上尼龙网，扎紧，放在自来水下流水冲洗；这样既方便冲洗，也避免了手或其他部件对材料的污染；

(3)脱水

将材料置于体积浓度由低到高的若干乙醇溶液中逐级脱水1.5h以上，然后在无水乙醇中脱水1h以上，并重复一次上述操作；

步骤(3)所述的若干乙醇溶液优选体积浓度分别为15％、30％、50％、70％、85％、95％的乙醇溶液；

步骤(3)的操作完成后，材料可在70％(体积浓度)乙醇溶液中脱水过夜；

(4)5级氯仿透明

将材料放入标有等距5分格标记的瓶中，并加入无水乙醇至5格处，透明处理0.5h以上；然后逐级换入氯仿，即每次吸出1格溶液，加入1格氯仿，透明处理0.5h以上；最后一级全部吸出，再加入氯仿至2.5格处；若材料放入乙醇氯仿后溶液出现浑浊，则表示材料脱水不彻底，应重新脱水；

(5)浸蜡