[发明专利]一种从发酵黑蒜中分离胶红酵母的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体来说涉及一种从发酵黑蒜中分离胶红酵母的方法。

背景技术

黑蒜又名发酵黑蒜，是由大蒜经高温发酵成的半成品，是用新鲜生蒜，带皮在发酵箱里发酵60-90天后制成的食品，黑蒜中的微量元素含量较高，味道酸甜，无蒜味，发酵黑蒜的抗氧化能力比普通大蒜的强。

胶红酵母属于担子菌纲，菌落为奶油状、粉红色至红色的粘液，是简单的假菌丝，细胞形状为圆形，为营养体细胞出芽生殖。富含虾青素、类胡萝卜素和β-葡聚糖。类胡萝卜素是一种橘黄色脂溶性化合物，具有营养增补剂和食品着色剂的双重功效。动物体内不能合成类胡萝卜素，必须由食物提供，它是动物体内维生素A的重要来源，有补肝明目的作用，可治疗夜盲症。类胡萝卜素也是一种抗氧化剂，进而防止老化和衰老引起的多种退化性疾病。同时，在抗癌、预防心脑血管疾病、白内障上有显著的功效。丙酮酸作为膳食补充剂，具有加速脂肪消耗、减轻体重等功效；对心脏有特殊的保护作用，可增强心脏肌肉的效能，减少心脏病或心脏局部缺血造成的损伤；同时，丙酮酸具有吞噬体内自由基和抑制自由基的生成等显著效果。

由于胶红酵母的粘性特别强，不易得到形态特征明显的单个菌落。

发明内容

本发明的目的在于提供一种容易得到形态特征明显的单个菌落，富含虾青素、类胡萝卜素和β-葡聚糖的从发酵黑蒜中分离胶红酵母的方法。

本发明的一种从发酵黑蒜中分离胶红酵母的方法，包括以下步骤：

(1)取发酵黑蒜3颗，研磨后放到250mL的生理盐水中，置于30℃的摇床中，震荡2h；

(2)改良PDA配方：在PDA培养基中，琼脂为22-25g/L，青霉素为150-200mg/L、200目石英砂为50-70g/L。

(3)将30mL上清液倒入改良PDA培养基中制成含菌培养基，倒平板置于30℃的培养箱中培养；

(4)2-3d后有长出了较多菌落，挑取一个单独菌落在改良PDA平板上画线分离，再次生长出单个菌落；

(5)反复从平板上挑取单个菌落转种，最后就得到纯种的胶红酵母；

(6)挑少许菌落制片在显微镜下观察，其显微形态为圆形或椭圆形，无性繁殖为单边芽殖。

菌种的保种和传代：

保种用的培养基为PDA培养基。

保存方法有2种：

(1)用15×200mm的试管，盛PDA培养基5ml，做成斜面，接种真菌，30℃培养2～3天，置4℃保存。3个月转种一次。

(2)甘油管保存法。挑取单个菌落置于5mL生理盐水中，震荡1分钟，取1.5mL的离心管加入0.5mL菌液和0.5mL40％已灭菌的甘油，混匀后置-40℃，一年转种一次。

分子生物学鉴定

将菌种接种到PDA培养基上活化2-3次，挑取单个菌落接种到100mL马铃薯液体培养基中，取1-2mL过夜培养的酵母菌培养液，加入1.5mL离心管中，室温10000rpm离心一分钟，弃上清，收集菌体。用SK8257_Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，进行PCR扩增，PCR采用的引物为ITS1：

5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；

ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。经PCR扩增后用1％琼脂糖凝胶电泳进行DNA电泳检测，最后将序列进行测序。胶红酵母H1(Rhodotorula mucilaginosa)FBKL3.0021的内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)的核酸序列长度为592个碱基，通过美国生物技术信息中心(National Center for Biorechnology Information,NCBI)进行序列同源性分析，将胶红酵母H1(Rhodotorula mucilaginosa)序列通过Blast比对，发现其与Rhodotorula mucilaginosa菌种的同源性达到了100％，结合形态学特征，根据MycoBank数据库鉴定该菌种为红酵母属中的胶红酵母。

该菌种已于2017年5月12日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)，保藏号：CCTCC M 2017254，名称为：胶红酵母H-1(Rhodotorula mucilaginosa H-1)。